本发明公开了一种耐热型逆转录酶突变体及其制备方法及应用,涉及基因工程和酶工程技术领域。所述的逆转录酶突变体的氨基酸序列与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比,在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第8位、第204位、第249位、第289位、第306位、第309位、第524位、第562位、第571位、第583位、第664位中的一种或多种位点进行突变,本发明的逆转录酶突变体的纯度可达到98%以上,实现了50℃、55℃逆转录温度的耐受同时还保留50%以上的逆转录酶活性,实现了一步法RT‑PCR,拓展了逆转录酶的应用效率和前景。