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[发明专利]一种丁酸梭菌分泌的抗菌肽及其制备方法和应用-CN201410030648.3有效
发明人： 汪以真;栾超 -专利权人：浙江大学
申请日： 2014-01-23 - 公布日： 2014-05-07 - 主分类号： C07K14/33 文献下载
摘要：本发明公开了一种丁酸梭菌分泌的抗菌肽及其氨基酸序列和应用。所述的抗菌肽氨基酸序列为序列表SEQIDNO:1所示，分子量为2264.6道尔顿，等电点为8.64。其制备方法是：硫酸铵沉淀培养基中丁酸梭菌分泌的抗菌肽，利用阳离子交换、分子筛层析和反向高效液相色谱法纯化抗菌肽。该抗菌肽具有显著的抗菌活性，且不会对猪的红细胞产生溶血作用，可用于开发制备饲用抗菌药物。
一种丁酸分泌抗菌及其制备方法应用

[发明专利]一种地衣芽孢杆菌分泌的抗菌肽及其制备方法和应用-CN201410021906.1有效
发明人： 汪以真;栾超 -专利权人：浙江大学
申请日： 2014-01-18 - 公布日： 2014-05-07 - 主分类号： C07K7/08 文献下载
摘要：本发明公开了一种地衣芽孢杆菌分泌的抗菌肽及其制备方法和应用。所述的抗菌肽氨基酸序列为序列表SEQIDNO.1所示，分子量为1290.4道尔顿，等电点5.23。其制备方法是：硫酸铵沉淀培养基中地衣芽孢杆菌分泌的的抗菌肽，利用阴离子交换、分子筛层析和反向高效液相色谱法纯化抗菌肽。该抗菌肽具有显著的抗菌活性，且不会对猪的红细胞产生溶血作用，可用于开发制备饲用抗菌药物。
一种地衣芽孢杆菌分泌抗菌及其制备方法应用

[发明专利]一种利用枯草芽孢杆菌表达外源蛋白的方法-CN201310308517.2无效
发明人： 汪以真;栾超 -专利权人：浙江大学
申请日： 2013-07-23 - 公布日： 2013-12-04 - 主分类号： C12N15/75 文献下载
摘要：本发明公开了一种利用枯草芽孢杆菌表达外源蛋白的方法。通过构建融合蛋白SUMO-CBF和SUMOprotease1枯草芽孢杆菌分泌表达载体，实现表达并纯化融合蛋白SUMO-CBF和SUMOprotease1；用重组表达得到的SUMOprotease1切割重组表达得到的SUMO-CBF释放重组抗菌肽CBF；通过亲和层析和阳离子交换纯化得到不含内毒素的抗菌肽CBF。纯化产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等均有显著的抑制作用。本发明为使用SUMO技术在枯草芽孢杆菌表达系统中重组表达阳离子抗菌肽提供了可能；融合蛋白不易形成包涵体，直接分泌至胞外，并且重组阳离子抗菌肽不含内毒素，省去了大量下游的纯化工作；尤其是利用同一个系统纯化外源蛋白，相辅相成，减少了外来污染物或者不纯物质的引入。
一种利用枯草芽孢杆菌表达蛋白方法

[发明专利]抗菌肽及其制备方法和应用-CN201310126503.9无效
发明人： 汪以真;韩菲菲;谢永刚;张海文;夏溪 -专利权人：浙江大学
申请日： 2013-04-11 - 公布日： 2013-10-02 - 主分类号： C07K7/08 文献下载
摘要：本发明公开了抗菌肽及其制备方法和应用。所述抗菌肽为猪乳铁蛋白肽LFP-20或改建抗菌肽LF-2或改建抗菌肽LF-6。所述的抗菌肽的制备方法为固相化学合成法，或利用基因工程表达技术将抗菌肽的编码基因克隆到载体上，然后在宿主细胞表达后获得。所述的基因工程表达技术所用的工程菌为基因工程菌P.pastorisSMD1168，表达载体为真核表达载体PICZαA。所述的抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。改建的抗菌肽能够提高LFP-20的体外杀菌活性和杀菌速度、增强其对细菌内膜和外膜的渗透性，从而提高LFP-20的杀菌力；改建抗菌肽LF-2、LF-6还具有更强的清除体内细菌能力；本发明还涉及一种用毕赤巴斯德酵母表达重组改建抗菌肽LF-6的方法。本发明过程简单，产物具有明显的抑菌活性。
抗菌及其制备方法应用

[发明专利]利用内含肽系统大肠杆菌表达乳铁蛋白改良肽LF-6的方法-CN201310126494.3无效
发明人： 汪以真;张海文;韩菲菲;栾超 -专利权人：浙江大学
申请日： 2013-04-11 - 公布日： 2013-07-17 - 主分类号： C12N15/12 文献下载
摘要：本发明公开了一种利用内含肽系统大肠杆菌表达乳铁蛋白改良肽LF-6的方法。步骤如下：a、PCR扩增具大肠杆菌密码子偏好性的改良肽LF-6目的基因；b、利用pTWIN1载体和改良肽LF-6目的基因构建改良抗菌肽LF-6的重组表达质粒及相应的克隆菌株；c、鉴定阳性转化子，亚克隆至大肠杆菌表达菌株；d、挑单克隆阳性大肠杆菌表达菌株接种至摇瓶，诱导表达后收集菌液，超声破碎离心获得含融合蛋白的上清；e、对含融合蛋白的上清进行在柱纯化与LF-6的切割释放及进一步通过RP-HPLC分析制备与质谱鉴定；f、对纯化所得抗菌肽LF-6进行抑菌活性验证。本发明利用内含肽融合表达系统在大肠杆菌中成功重组表达猪乳铁蛋白改良肽LF-6，实现了在柱纯化与无酶切割释放，简单易行成本低。
利用内含系统大肠杆菌表达铁蛋白改良 lf 方法

[发明专利]微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌和最小杀菌浓度的方法-CN201310065813.4有效
发明人： 汪以真;李治学;韩菲菲;黄霞;刘丹 -专利权人：浙江大学
申请日： 2013-03-01 - 公布日： 2013-06-26 - 主分类号： C12Q1/18 文献下载
摘要：本发明公开了一种微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法，包括以下步骤：1）试剂配制：配制MHB培养基；2）细菌悬液制备：复苏细菌至对数生长期，制备浓度一定的细菌悬液；3）细菌悬液计数：倍比稀释步骤2）中的细菌悬液后滴板计数；4）药剂稀释：倍比稀释药剂至不同测试浓度梯度；5）测定最小抑菌浓度：将步骤4）中稀释好的药剂与步骤2）中制备的细菌悬液混合后培养，观察是否有肉眼可见的细菌沉淀；6）测定最小杀菌浓度：将步骤5）中有抑菌效果的测试滴板后培养，观察是否有菌落生长。采用该方法测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度具有干扰小、微量、方便、快捷的特点。
微量测定阳离子抗菌最小杀菌浓度方法

[发明专利]羧甲基化阴沟肠杆菌多糖及其制备方法和应用-CN201210522681.9有效
发明人： 汪以真;黄明;王友明;路则庆;靳明亮 -专利权人：浙江大学
申请日： 2012-12-04 - 公布日： 2013-04-03 - 主分类号： C08B37/00 文献下载
摘要：本发明公开了一种羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：1）将阴沟肠杆菌胞外多糖溶于异丙醇中，滴加NaOH水溶液，继续搅拌0.8～1.2h后，加入1.8～2.2g氯乙酸，然后于50℃～70℃恒温水浴中反应2～4h；2）将步骤1）所得的反应体系经调节pH、沉淀、透析、冷冻干燥；得到羧甲基化多糖。该羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖取代度为0.68-0.86，该多糖的红外光谱中在1602cm-1和1426cm-1处出现了COO-的对称和非对称伸缩振动特征吸收峰。其能作为抗氧化剂。
甲基化阴沟杆菌多糖及其制备方法应用

[发明专利]葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物及其制备方法和应用-CN201210441022.2有效
发明人：王凤芹;杨航仙;汪以真 -专利权人：浙江大学
申请日： 2012-11-07 - 公布日： 2013-02-20 - 主分类号： C07D307/33 文献下载
摘要：本发明公开了葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物及其制备方法和应用。取8g/mL的葡萄糖醛酸0.5mL于水解管中，55℃水浴加热，氮气吹干；然后加入乙硫醇2mL和三氟乙酸1mL，25℃水浴磁力搅拌25分钟，55℃水浴加热，氮气吹干；然后加入醋酐2mL和吡啶2mL，55℃水浴，磁力搅拌5小时，得到葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物。取岩藻糖、葡萄糖、木糖、半乳糖及葡萄糖醛酸应用以上方法直接进入气相色谱-质谱联用分析得到岩藻糖、葡萄糖、木糖、半乳糖及葡萄糖醛酸的含量。本发明得到了葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物；对糖醛酸含量的测定避免了使用对水分十分敏感的硅醚化试剂，能够有效提高样品检测的可操作性和准确性；能够同时检测中性糖和酸性糖。
葡萄糖醛酸硫醇乙酸衍生物及其制备方法应用

[发明专利]猪FLJ小干扰RNA表达载体的构建、鉴定法及用途-CN201110440124.8无效
发明人： 汪以真;伍婷;袁章琴 -专利权人：浙江大学
申请日： 2011-12-25 - 公布日： 2012-06-27 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明公开了一种猪FLJ有效小干扰RNA表达载体的构建方法，包括以下步骤：1)、根据载体的信息和靶序列设计3对含9个核苷酸的loop环的siRNA引物，9个核苷酸为：TTCAAGAGA；2)、RNAi表达载体的构建：siRNA引物退火后与双酶切的RNAi载体连接转化，得到RNAi表达载体的重组质粒。本发明还同时提供了对利用上述方法构建所得的猪FLJ有效小干扰RNA表达载体进行鉴定的方法。本发明还同时提供了利用上述方法构建所得的猪FLJ有效小干扰RNA表达载体的用途：用于研究FLJ基因对猪肌内脂肪沉积的影响。
flj 干扰 rna 表达载体构建鉴定用途

[发明专利]小鼠pTarget/mutated-LPL超表达载体的构建及用途-CN201110392772.0无效
发明人：向兰;汪以真;戚建华;黄艳娜 -专利权人：浙江大学
申请日： 2011-12-01 - 公布日： 2012-06-13 - 主分类号： C12N15/64 文献下载
摘要：本发明提供一种构建小鼠pTarget/mutated-脂蛋白脂酶超表达载体的方法，通过提取正常ICR雄性小鼠白色脂肪组织中的RNA，反转录为cDNA，得到小鼠脂蛋白脂酶的DNA片段，并回收目的DNA片段连至pTarget载体，转化TOP10感受态细胞中，构建得到pTarget/mutated-LPL超表达载体的重组质粒。所构建的超表达载体对脂蛋白脂酶具有很好的增强基因表达量的效果。本发明的载体构建方法简单、可行，构建的超表达载体能够特异、高效地增强LPL基因的表达，为开展LPL在动物脂肪代谢的功能研究具有重要的意义，可在建立动物模型进行脂肪代谢调节的拮抗研究中应用。
小鼠 ptarget mutated lpl 表达载体构建用途

[发明专利]小鼠Myogenin基因超表达载体的构建方法及用途-CN201110202707.7无效
发明人： 汪以真;朱琳娜;郭佳;韩菲菲;王新霞;冯杰 -专利权人：浙江大学
申请日： 2011-07-20 - 公布日： 2012-02-08 - 主分类号： C12N15/64 文献下载
摘要：本发明公开了一种小鼠MyoG表达载体的构建方法，包括以下步骤：1)根据载体的信息和靶序列设计并合成2对MyoG mRNA全长引物；2)表达载体的构建：引物退火后与pTARGETTM载体连接转化，得到小鼠MyoG表达载体的重组质粒。本发明的小鼠MyoG表达载体能用于研究MyoG基因对肉质的调控作用。
小鼠 myogenin 基因表达载体构建方法用途

[发明专利]大黄鱼甘油三酯脂酶ATGL基因及其应用-CN201110274221.4无效
发明人：王新霞;汪以真 -专利权人：浙江大学
申请日： 2011-09-16 - 公布日： 2011-12-28 - 主分类号： C12N15/55 文献下载
摘要：本发明公开了一种大黄鱼甘油三酯脂酶ATGL基因，为SEQ ID NO：1所示或SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列。本发明还同时公开了编码上述大黄鱼甘油三酯脂酶ATGL基因的蛋白质，为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。该大黄鱼甘油三酯脂酶ATGL基因的用途是：能用于大黄鱼的脂肪分解。该基因对于进一步深入了解大黄鱼的脂肪代谢过程，并通过营养手段调控大黄鱼脂肪代谢，从而减少大黄鱼脂肪沉积起到重要作用。
大黄鱼甘油三酯脂酶 atgl 基因及其应用

[发明专利]小鼠脂联素基因超表达载体的构建及用途-CN201110088270.9无效
发明人：向兰;汪以真;戚建华;黄艳娜 -专利权人：浙江大学
申请日： 2011-04-09 - 公布日： 2011-10-05 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明提供一种小鼠脂联素基因超表达载体的构建方法，通过将RT-PCR技术克隆得到的小鼠脂联素片段并连接到pTarget哺乳动物表达载体系统上，转化大肠杆菌DH5α，构建得到pTarget/ADP超表达载体的重组质粒，构建好的pTarget/ADP超表达载体对ADP具有很好的增强基因表达量的效果。本发明开拓了目前研究动物脂肪代谢调控和基因功能研究的思路。所用的超表达载体方便易得，载体构建方法简单、可行，能够特异、高效地增强ADP基因的表达，可在制备治疗肥胖及代谢性综合症药物中的应用。或在建立动物模型进行ADP对糖和脂肪代谢的调节及肌纤维生长，发育的影响研究中的应用。
小鼠脂联素基因表达载体构建用途

[发明专利]大黄鱼脂肪细胞体外培养方法-CN201110030738.9无效
发明人：王新霞;汪以真 -专利权人：浙江大学
申请日： 2011-01-27 - 公布日： 2011-08-03 - 主分类号： C12N5/077 文献下载
摘要：本发明公开了一种大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，依次包括以下步骤：1）取大黄鱼腹腔腹壁的脂肪组织；2）将上述脂肪组织经过细胞分散处理，得大黄鱼前体脂肪细胞；3）将大黄鱼前体脂肪细胞接入完全培养基中，吹打均匀，制成细胞悬液；完全培养基为含20%胎牛血清培养液；4）原代培养：将细胞悬液在24～26℃条件下，培养成贴壁生长的前体脂肪细胞。待步骤4）所述的原代培养的细胞达到70～80%汇合时，可进行传代接种培养。使用本发明的方法能有效地实现大黄鱼脂肪细胞的体外培养。
大黄鱼脂肪细胞体外培养方法

[发明专利]小鼠Leptin超表达载体的构建及用途-CN201010555731.4无效
发明人：向兰;汪以真;戚建华;黄艳娜 -专利权人：浙江大学
申请日： 2010-11-19 - 公布日： 2011-05-18 - 主分类号： C12N15/63 文献下载
摘要：本发明提供一种通过亚克隆技术构建小鼠Leptin超表达载体的方法，通过将pBlue-script-mob质粒双酶切后得到的小鼠Leptin片段连接到pVR表达载体上并转化大肠杆菌DH5α，构建得到pVR-mob超表达载体的重组质粒，构建好的超表达载体对Leptin具有很好的增强基因表达量的效果。本发明的载体构建方法简单、可行，构建的超表达载体能够特异、高效地增强Leptin基因的表达，为开展Leptin在动物脂肪代谢和肌纤维分型的功能研究具有重要的意义。本发明提供的超表达载体可在制备治疗肥胖及代谢性综合症(糖尿病)药物中的应用。也可在建立动物模型进行糖和脂肪代谢的调节及肌纤维生长，发育的影响研究中的应用。
小鼠 leptin 表达载体构建用途