[发明专利]小鼠pTarget/mutated-LPL超表达载体的构建及用途无效
申请号: | 201110392772.0 | 申请日: | 2011-12-01 |
公开(公告)号: | CN102492713A | 公开(公告)日: | 2012-06-13 |
发明(设计)人: | 向兰;汪以真;戚建华;黄艳娜 | 申请(专利权)人: | 浙江大学 |
主分类号: | C12N15/64 | 分类号: | C12N15/64;C12Q1/68;A61K49/00;G01N33/53;G01N33/68 |
代理公司: | 杭州求是专利事务所有限公司 33200 | 代理人: | 张法高;赵杭丽 |
地址: | 310027 浙*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | 本发明提供一种构建小鼠pTarget/mutated-脂蛋白脂酶超表达载体的方法,通过提取正常ICR雄性小鼠白色脂肪组织中的RNA,反转录为cDNA,得到小鼠脂蛋白脂酶的DNA片段,并回收目的DNA片段连至pTarget载体,转化TOP10感受态细胞中,构建得到pTarget/mutated-LPL超表达载体的重组质粒。所构建的超表达载体对脂蛋白脂酶具有很好的增强基因表达量的效果。本发明的载体构建方法简单、可行,构建的超表达载体能够特异、高效地增强LPL基因的表达,为开展LPL在动物脂肪代谢的功能研究具有重要的意义,可在建立动物模型进行脂肪代谢调节的拮抗研究中应用。 | ||
搜索关键词: | 小鼠 ptarget mutated lpl 表达 载体 构建 用途 | ||
【主权项】:
一种小鼠脂蛋白脂酶超表达载体的构建方法,通过以下步骤实现:(1)提取正常ICR雄性小鼠白色脂肪组织中的RNA,反转录为CDNA,得到小鼠脂蛋白脂酶 DNA片段;(2)RT‑PCR 扩增:以(1)得到的CDNA为模板, 上下游引物为:脂蛋白脂酶L‑F: 5'‑ATGGAGAGCAAAGCCCTG‑3'脂蛋白脂酶‑R: 5'‑TCAGCCAGACTTCTTCAGAG‑3'用pfu DNA聚合酶进行PCR反应,扩增条件为93℃ 3分钟预变性后,94℃ 50秒、56℃ 45秒‑2分钟、72℃ 30秒,共30个循环,最后一轮循环完成后再72℃延伸10 分钟,反应完毕后,用1%琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果,同时做内参基因;(3)表达载体构建:将回收的目的DNA片段连至pTarget载体.转化TOP10感受态细胞中,涂布含100 mg/mL 氨苄青霉素的LB平板上,过夜培养,挑取单菌落至含有同样浓度Amp的液体LB培养液中.抽提质粒,用EcoRI酶切质粒,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
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