[发明专利]小鼠脂联素基因超表达载体的构建及用途无效
申请号: | 201110088270.9 | 申请日: | 2011-04-09 |
公开(公告)号: | CN102206677A | 公开(公告)日: | 2011-10-05 |
发明(设计)人: | 向兰;汪以真;戚建华;黄艳娜 | 申请(专利权)人: | 浙江大学 |
主分类号: | C12N15/85 | 分类号: | C12N15/85;A61K48/00;A61P3/00;A61P3/04;A61P3/10;A01K67/027 |
代理公司: | 杭州求是专利事务所有限公司 33200 | 代理人: | 张法高;赵杭丽 |
地址: | 310027 浙*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | 本发明提供一种小鼠脂联素基因超表达载体的构建方法,通过将RT-PCR技术克隆得到的小鼠脂联素片段并连接到pTarget哺乳动物表达载体系统上,转化大肠杆菌DH5α,构建得到pTarget/ADP超表达载体的重组质粒,构建好的pTarget/ADP超表达载体对ADP具有很好的增强基因表达量的效果。本发明开拓了目前研究动物脂肪代谢调控和基因功能研究的思路。所用的超表达载体方便易得,载体构建方法简单、可行,能够特异、高效地增强ADP基因的表达,可在制备治疗肥胖及代谢性综合症药物中的应用。或在建立动物模型进行ADP对糖和脂肪代谢的调节及肌纤维生长,发育的影响研究中的应用。 | ||
搜索关键词: | 小鼠 脂联素 基因 表达 载体 构建 用途 | ||
【主权项】:
一种小鼠脂联素基因超表达载体的构建方法,其特征在于,通过以下步骤实现:(1)提取正常ICR雄性小鼠白色脂肪组织中的RNA,反转录为CDNA,得到小鼠ADP DNA片段,序列如SEQ ID NO:1所示;(2)RT‑PCR 扩增:以(1)得到的CDNA为模板,上下游引物为:SEQ ID NO:2 5'‑ATGCTACTGTTGCAAGCTCT‑3' SEQ ID NO:3 5'‑TCAGTTGGTATCATGGTAGA‑3'用pfu DNA聚合酶进行PCR反应,扩增条件为93℃、3分钟预变性后,94℃50 秒、56℃45秒‑2分钟、72℃30秒共30个循环,最后1轮循环完成后再72℃延伸10 分钟,反应完毕后,用1%琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果; (3)表达载体构建:将回收的目的DNA片段连至pTarget载体.转化大肠杆菌‑TOP10感受态细胞中,涂布含100mg/mL氨苄西林的LB平板上,过夜培养,挑取单菌落至含有同样浓度Amp的液体培养液中.抽提质粒,用EcoRI酶切质粒,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
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