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[发明专利]一种蛋白质定向进化的方法-CN202310652836.9在审
发明人： 方柏山;林建文;黄世阳 -专利权人：厦门大学
申请日： 2023-06-02 - 公布日： 2023-10-24 - 主分类号： C12N15/10 文献下载
摘要：本发明提供一种蛋白质定向进化的方法，包括：1)构建筛选质粒，所述筛选质粒的结构为luxpR启动子1‑核糖体结合位点‑luxR‑终止子‑luxpR蛋白基因‑核糖体结合位点‑细菌裂解蛋白基因lysis‑终止子‑luxpR启动子2‑核糖体结合位点‑目的蛋白基因‑终止子；2)采用易错PCR扩增目的蛋白基因得易错PCR产物；3)通过酶连反应将筛选质粒和易错PCR的产物连接，构建重组质粒；4)将重组质粒转化感受态细胞，涂布至含有目的蛋白基因的底物和抗生素的平板上，培养一段时间，筛选出含目的蛋白基因的突变株；5)对筛选出的含目的蛋白基因的突变株表达的突变蛋白进行测序，获得突变蛋白的序列。本发明的方法极大程度减少了蛋白质筛选工作时间和工作量。
一种蛋白质定向进化方法

[发明专利]一种芽孢杆菌群体感应淬灭酶AiiA酶及其基因序列与应用-CN202310651907.3在审
发明人： 方柏山;邢广恬 -专利权人：厦门大学
申请日： 2023-06-02 - 公布日： 2023-08-29 - 主分类号： C12N9/18 文献下载
摘要：本发明提供一种芽孢杆菌群体感应淬灭酶AiiA酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该芽孢杆菌群体感应淬灭酶AiiA酶的酶活性高，能够高效降解高丝氨酸内酯AHL，从而显著解决在疾病防治中使用抗生素易导致细菌产生耐药性的问题。
一种芽孢杆菌群体感应淬灭酶 aiia 及其基因序列应用

[发明专利]一种发酵控制方法、装置、设备以及可读存储介质-CN202310658351.0在审
发明人：师佳;徐成蹊;洪文晶;方柏山 -专利权人：厦门大学
申请日： 2023-06-05 - 公布日： 2023-08-25 - 主分类号： C12Q3/00 文献下载
摘要：本发明实施例提供了一种发酵控制方法、装置、设备以及可读存储介质，通过不间断地获取针对发酵液的加碱变化参数，在加碱变化参数满足第一预设条件时，根据加碱变化参数确定出针对发酵液底物的基本流加速率，并基于基本流加速率进行补料操作。在发酵液发酵时间处于预设周期内时，获取发酵液在当前预设周期内的第一发酵状态参数，并利用预设的预测控制算法处理第一发酵状态参数，以得到发酵底物在当前预设周期内的理论补料变化参数。最后，利用理论补料变化参数，对发酵液在下一预设周期内的补料操作进行控制。在基本流加速率的基础上，利用预测控制算法对发酵液在下一预设周期内的补料操作进行控制，能进一步提高补料速率控制的准确性。
一种发酵控制方法装置设备以及可读存储介质

[发明专利]基于丁酸梭菌发酵的1,3-丙二醇的发酵液蒸发浓缩模拟方法-CN202211653613.6在审
发明人： 方柏山;王子钦;罗菊香 -专利权人：厦门大学
申请日： 2022-12-22 - 公布日： 2023-06-09 - 主分类号： B01D1/00 文献下载
摘要：本发明提供了一种基于丁酸梭菌发酵的1,3‑丙二醇的发酵液蒸发浓缩模拟方法，其包括：采用两相闪蒸器模型和换热器模型构建多效蒸发浓缩模型；通过所述进料口进行进料；其中，料液包括PDO、甘油和水；设定进料流量、生蒸汽压力和蒸发温度；控制浓缩至设定的发酵液体积，并采集不同操作压力下的PDO损失率，以获得PDO损失率与发酵液体积的关系；通过改变两相闪蒸器模型的蒸发温度模拟PDO损失率与浓缩液含水量的关系；根据PDO损失率与发酵液体积的关系、PDO损失率与浓缩液含水量的关系优化1,3‑丙二醇的发酵液蒸发浓缩的工作参数。本发明能优化发酵液蒸发浓缩的工作参数。
基于丁酸发酵丙二醇蒸发浓缩模拟方法

[发明专利]一种苹果酸脱氢酶PbMDH及其编码序列和应用-CN201811573414.8有效
发明人： 方柏山;王雅丽;张永辉;苏洁茹 -专利权人：厦门大学
申请日： 2018-12-21 - 公布日： 2021-01-26 - 主分类号： C12N9/04 文献下载
摘要：本发明提供一个来自于蒌叶假单胞菌Pseudomonas beteli的苹果酸脱氢酶PbMDH，该苹果酸脱氢酶的编码基因及其应用。本发明提供的带有苹果酸脱氢酶PbMDH核苷酸序列的克隆质粒可以通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节所述编码基因的表达，能够高效表达苹果酸脱氢酶PbMDH，为苹果酸脱氢酶的生产提供有效途径。本发明提供的海洋来源的苹果酸脱氢酶具有耐盐耐高温的性能，具有重要的工业化应用前景。
一种苹果酸脱氢酶 pbmdh 及其编码序列应用

[发明专利]一种厌氧培养装置及其应用-CN201810106626.9有效
发明人： 方柏山;张俊楠;付友思 -专利权人：厦门大学
申请日： 2018-02-02 - 公布日： 2021-01-15 - 主分类号： C12M1/38 文献下载
摘要：本发明公开了一种厌氧培养装置及其应用，装置包括厌氧系统、发酵系统和控制系统；所述厌氧系统和发酵系统间通过管路连接，形成厌氧的气体循环，所述控制系统以分组形式实现单独控制各罐体的pH和温度条件；分组的模块化组装，操作便捷，实验过程重复性强，应用范围广，特别适合体外肠道菌群培养和厌氧菌的代谢进化研究。
一种培养装置及其应用

[发明专利]一种基于丁酸梭菌的1，3-丙二醇和乳酸联产的发酵生产方法-CN201810202334.5有效
发明人： 方柏山;刘昊霖;张瑷珲 -专利权人：厦门大学
申请日： 2018-03-12 - 公布日： 2020-10-09 - 主分类号： C12P7/18 文献下载
摘要：本发明公开了一种基于丁酸梭菌的1，3‑丙二醇和乳酸联产的发酵生产方法，在发酵培养基中添加活性炭进行发酵生产，通过该活性炭对发酵副产物的吸附，解除副产物抑制作用，同时，对发酵液中甘油浓度进行检测，通过流加培养基将发酵过程中菌体生长处于稳定期的甘油浓度控制在5～15g/L，其中活性炭的添加量为每升发酵培养基添加30～100g活性炭。
一种基于丁酸丙二醇乳酸联产发酵生产方法

[发明专利]一种利用活性包涵体制备光学纯L-叔亮氨酸的方法-CN201711094066.1有效
发明人： 方柏山;张永辉 -专利权人：厦门大学
申请日： 2017-11-08 - 公布日： 2020-10-09 - 主分类号： C12P13/04 文献下载
摘要：本发明公开了一种利用活性包涵体制备光学纯L‑叔亮氨酸的方法，包括如下步骤：(1)制备双功能酶活性包涵体，该双功能酶活性包涵体的活性成分为一融合双功能酶，该融合双功能酶包括通过连接肽相连的一亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase，LeuDH)部和一用于辅酶NAD+再生的多聚酶部；(2)将上述双功能酶活性包涵体加入pH 6.0～10.0的反应混合液重悬，然后于20～40℃反应，反应期间控制pH为6.0～10.0；所述反应混合液包含50～1000mM三甲基丙酮酸、50‑1000mM甲酸铵和0.05～5mM的辅酶NAD+。
一种利用活性包涵体制光学亮氨酸方法

[发明专利]一种检测人血清中肿瘤标志物的微流控芯片-CN201911086569.3在审
发明人： 方柏山;王秋鹏;胡芸芸;薛悦榕;梁杨 -专利权人：厦门大学
申请日： 2019-11-08 - 公布日： 2020-06-23 - 主分类号： G01N33/574 文献下载
摘要：本发明公开了一种检测人血清中肿瘤标志物的微流控芯片，基于适配体技术，具有至少一检测通道，该检测通道包括依次连通的一连通进样装置的可开闭的进样孔、一孵育腔室和一检测腔室。本发明使用微流控技术建立一套全自动化的肿瘤标志物检测体系，可大大降低肿瘤癌症早期初筛实验室对于场地的要求，将原本需要的4‑5个相连而又独立的实验室群缩小为一个实验室台面。
一种检测血清肿瘤标志微流控芯片

[发明专利]一种高通量检测菌株耐有机溶剂氧化还原酶的方法-CN201610548837.9有效
发明人：王世珍;方柏山;林鹏 -专利权人：厦门大学
申请日： 2016-07-13 - 公布日： 2020-01-31 - 主分类号： C12Q1/26 文献下载
摘要：本发明公开了一种高通量检测菌株耐有机溶剂氧化还原酶的方法，涉及酶检测和生物催化剂的高通量筛选。包括菌株培养、细胞破胞、进一步统一多种酶的反应条件(有机溶剂、温度、缓冲液及激活因子)、构建多种有机溶剂体系酶活性高通量检测平台等。通过在粗酶液中加入不同浓度的氯化钠，稳定耐盐、嗜盐酶的结构，使其正确折叠，减少假阴性的结果；并通过加入聚乙烯亚胺，提高氧化还原酶的稳定性，提高筛选效率。运用所建立平台可对大量菌株同时进行多种氧化还原酶耐多种有机溶剂耐受性的检测，有利于最大限度地同时挖掘所考察菌株的应用潜力,获得工业生物催化应用所需的耐有机溶剂的氧化还原酶，并提高筛选效率，减少人力、物力及时间成本的投入。
一种通量检测菌株有机溶剂氧化还原酶方法

[发明专利]一种自组装固定化甲酸脱氢酶-亮氨酸脱氢酶融合酶的制备方法-CN201910193292.8在审
发明人： 方柏山;廖浪星;张永辉 -专利权人：厦门大学
申请日： 2019-03-14 - 公布日： 2019-06-28 - 主分类号： C12N9/02 文献下载
摘要：本发明公开了一种自组装固定化甲酸脱氢酶‑亮氨酸脱氢酶融合酶的制备方法，本发明选用刚性多肽作为连接肽融合双酶，利用亚基间形成四级结构的多聚作用作为驱动力，采用浓缩的方法促进多聚相互作用实现融合酶的自组装固定化。本发明所获得的甲酸脱氢酶‑亮氨酸脱氢酶融合酶的自组装固定化方法简单、自组装程度高，具有较好的温度稳定性、重复使用稳定性及催化效率。制备条件温和，制备工艺简单易行，所得自组装融合酶呈片层结构，具有自身固定化、组装程度高、重复利用率高等优点。
自组装固定化融合亮氨酸脱氢酶甲酸脱氢酶制备温度稳定性重复利用率催化效率片层结构四级结构制备工艺制备条件连接肽驱动力多肽组装浓缩

[发明专利]一种海洋菌株及其胺脱氢酶催化制备手性胺的方法-CN201610069548.0有效
发明人：王世珍;方柏山;任红;林鹏 -专利权人：厦门大学
申请日： 2016-02-01 - 公布日： 2019-06-14 - 主分类号： C12P13/02 文献下载
摘要：本发明公开了一种海洋菌株及其胺脱氢酶催化制备手性胺的方法，属于生物法不对称合成手性化合物技术领域。本发明筛选得到来源于海洋的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)，在加入底物酮、氨基供体和辅助底物情况下，利用该菌株的全细胞及粗酶液催化酮不对称还原胺化制备手性胺。本发明确定了该菌株全细胞催化和粗酶液催化的不对称还原胺化的反应体系和反应条件。本发明在生物催化制备手性胺领域具有较好的工业应用前景，对于今后海洋新型生物催化剂的开发和手性胺的绿色合成方法的研究具有重要意义。
一种海洋菌株及其脱氢酶催化制备手性方法

[发明专利]一种利用氧化石墨烯-金属离子配位固定化酶的方法-CN201610541498.1有效
发明人：王世珍;方柏山;林鹏 -专利权人：厦门大学
申请日： 2016-07-11 - 公布日： 2019-06-14 - 主分类号： C12N11/14 文献下载
摘要：本发明公开了一种利用氧化石墨烯‑金属离子配位固定化酶的方法，属于固定化酶技术领域。在固定化过程中，过渡态金属离子可以与氧化石墨烯的羧基配位，并通过配位作用固定化甲酸脱氢酶。片层结构的氧化石墨烯是一种优良的固定化载体，表面带有环氧基、羰基、羧基等功能性基团，负载面积大。利用金属离子的配位作用，不仅可使氧化石墨烯均匀分散，增大酶的负载量，并且通过与酶组氨酸标签的配位相互作用，实现酶在石墨烯上的固定化。本发明的优点在于工艺简单、制备条件温和、固定化率高。所得固定化酶的温度稳定性、pH稳定和和重复使用稳定性明显增强，同时具有较高的酶活性回收率。
一种利用氧化石墨金属离子固定方法

[发明专利]一种降解柚皮苷的菌种及方法-CN201510520364.7有效
发明人： 方柏山 -专利权人： 方柏山
申请日： 2015-08-18 - 公布日： 2019-04-26 - 主分类号： C12N1/20 文献下载
摘要：本发明涉及一种降解柚皮苷的菌种及方法，提供一种能够降解柚皮苷的菌种叶杆菌Wb51b(Phyllobacterium sp.)。在一定条件下，以2g/L的柚皮苷为唯一碳源培养菌种72h，菌体浓度达0.45g/L，柚皮苷含量降为0.0037g/L，几乎被完全降解。直接用游离细胞降解0.6g/L的柚皮苷，反应时间30min，柚皮苷的含量降为0.1g/L，降解率达83.3％；用固定化细胞降解1.2g/L柚皮苷，反应时间60min，柚皮苷的含量降为0.076g/L，降解率达93.7％。该菌种能够高效降解柚皮苷，对营养要求简单、易培养；此外，该菌种无致病性，可直接应用于食品工业。
一种降解柚皮苷菌种方法

[发明专利]一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法-CN201610146280.6有效
发明人： 方柏山;任红;王世珍 -专利权人：厦门大学
申请日： 2014-08-08 - 公布日： 2019-01-08 - 主分类号： C12N1/20 文献下载
摘要：一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，涉及手性苯丙氨酸。将菌种接入2216L培养基中培养，得发酵液，离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配制成细胞液；所述菌种为南海芽孢杆菌(Bacillus nanhaiensis)DSF‑15A2，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.8969；在细胞液中，加入苯丙酮酸和氨基供体作为底物，再加入辅助底物用于辅酶循环再生，反应后得到含有产物L‑苯丙氨酸的反应液，离心去除沉淀，上清液加入等量的甲醇，震荡混合均匀，离心去除沉淀，上清液稀释后进行测定，苯丙酮酸的浓度用高效液相色谱检测，产物L‑苯丙氨酸的浓度和对映体过量值用高效液相色谱测定。
一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸方法

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