[发明专利]酿酒酵母内源角鲨烯单加氧酶突变体及应用

说明书

本发明公开了酿酒酵母内源角鲨烯单加氧酶突变体及应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明提供的酿酒酵母角鲨烯单加氧酶突变体G27S、G30S、G25S、Y90F、Y90A、Q63N、C416A、I483A、G27S/Y90A、G27S/I483A、Y90A/I483A、G27S/Y90A/I483A的酶活性比野生型均有不同程度的降低，表达上述突变体的酿酒酵母胞内角鲨烯产量可提高了40％以上，角鲨烯积累量可高达6.82g/L，有利于扩大其工业化应用范围，实现大规模的安全生产。

技术领域

本发明涉及酿酒酵母内源角鲨烯单加氧酶突变体及应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

角鲨烯(squalene)是一种重要的萜类化合物，它是许多生物活性化合物的前体，如类固醇和藿烯等。角鲨烯本身具有较高的应用价值，可用于化妆品行业作为润肤霜。角鲨烯对人体健康也有益，具有包括抗肿瘤、抗真菌/真菌，增强机体免疫能力，降低胆固醇等作用。另外，角鲨烯还有一种重要的用途是制作稳定的乳化液，例如疫苗、药物及其他的药用底物。目前，角鲨烯传统的生产方法主要通过非法手段从鲨鱼肝提取或低效的从植物中提取，但鉴于其来源有限，价格昂贵，利用微生物生产角鲨烯具有可持续性，环境友好等的优点，故与传统角鲨烯生产相比采用微生物发酵法生产角鲨烯具有很好的前景。

角鲨烯的合成从乙酰辅酶A开始，首先通过HMG-CoA合成酶催化生成3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)，接下来HMG-CoA还原酶(HMGR)催化HMG-CoA生成甲羟戊酸(Mevalonate，MVA)，是MVA途径中第一个限速酶，IDI1编码的异戊烯焦磷酸酯异构酶催化异戊烯二磷酸(IPP)形成烯丙基二磷酸(DMAPP)，其与HMG1是细胞质萜类化合物的代谢中的重要调控点。接下来通过一系列Erg蛋白酶催化，角鲨烯合成酶(Erg9p)将法尼烯基焦磷酸(FPP)催化形成角鲨烯。角鲨烯单加氧酶Erg1催化2,3-环氧角鲨烯的形成。天然酿酒酵母MVA途径中角鲨烯几乎不积累。现有技术中有文献记载了对酿酒酵母进行基因工程改造提高角鲨烯产量的方案，但仍存在发酵周期长、产量有限等问题。

目前，角鲨烯主要以微生物发酵的方式生产。酿酒酵母菌Saccharomycescerevisiae是最主要的生产菌株，针对酿酒酵母菌生产角鲨烯的研究主要集中在提高角鲨烯产量和产率等方面。角鲨烯单加氧酶是催化角鲨烯生成环氧角鲨烯的关键酶，研究人员发现特比萘芬能有效抑制角鲨烯单加氧酶的催化活性，而特比萘芬作为抗生素添加为角鲨烯的工业化生产应用带来困难。如何选择合适的方式对角鲨烯单加氧酶进行改性，获得理想的角鲨烯单加氧酶活性，在保持低活性的基础上不影响酵母细胞生长，从而扩大其工业应用是目前亟待解决的问题。

已有研究对人源的角鲨烯单加氧酶进行蛋白质结构的解析，并对不同来源的角鲨烯单加氧酶进行蛋白质序列的比对，但目前还没有报道对酿酒酵母来源的ERG1的蛋白质结构及功能研究。因此，筛选具有低角鲨烯催化活性的角鲨烯单加氧酶对于改造高产角鲨烯的酿酒酵母菌株具有重要的意义。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明利用基因工程和酶工程的手段，降低角鲨烯单加氧酶的活性，提高角鲨烯的产量，为其工业化生产创造了条件。

本发明提供了如下(a)或(b)的角鲨烯单加氧酶突变体：

(a)在SEQ ID NO.1的氨基酸基础上，第25位、27位、30位、63位、90位、416位或483位进行了一个或多个突变的角鲨烯单加氧酶突变体，

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有角鲨烯单加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

在一种实施方式中，所述亲本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。