[发明专利]一种用于检测桃拉综合征病毒的CRISPR-Cas13a等温检测引物组及应用

说明书

本发明公开了一种用于检测桃拉综合征病毒的CRISPR‑Cas13a等温检测引物组及应用。所述CRISPR‑Cas13a等温检测引物组包括一个包含三条crRNA的crRNA组和一个RNA探针，三条crRNA分别命名为：TSV‑crRNA3、TSV‑crRNA5和TSV‑crRNA7，RNA探针命名为TSV‑Probe。本发明检测操作简便快速，适合现场检测；特异性强；检测灵敏度高，可达到10²copy/反应；准确率高、可靠，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术检测技术领域，特别是涉及一种用于检测桃拉综合征病毒的CRISPR-Cas13a等温检测引物组及应用。

背景技术

对虾桃拉综合征俗称＂红尾病＂，是由桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus，TSV)引起的一种严重传染性对虾疾病。症状急性期以虾体变红、软壳，过渡期以角质上皮不规则黑化为特征。

桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus，TSV)是一种无囊膜的单股正链RNA病毒，病毒颗粒径长31～32nm，属于小RNA病毒家族，其主要宿主为南美对虾，该病毒能够感染甲壳上皮(如附肢、鳃、胃、食道、后肠)、结缔组织等，造成病虾不摄食，消化道内无食物；游泳无力、反应迟钝；甲壳变软，虾体变红，尤其是尾扇变红，所以本病又称为红尾病，一般幼虾的死亡率高达80％。造成对虾养殖业重大的经济损失，目前已被世界动物卫生组织(OIE)列为必须要进行申报的病毒之一。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的检测方法是减少该病发生和危害的重要途径。

目前，检测对虾是否感染桃拉综合征病毒通常采用病理学显微镜观察、生化测定、免疫学试验、细胞培养、PCR和液相芯片技术等，但这些方法操作繁琐、耗时长、检测仪器昂贵，在养殖场实践应用中存在很多困难，很难适应当前快速、准确检测的需要，不适合基层快速筛查。

比如，公开号为CN101915834A的发明涉及一种对虾桃拉综合征病毒(TSV)胶体金检测试纸条，试纸条底板一端为胶体金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体结合物玻璃纤维膜，抗体固相硝酸纤维素膜位于中间，其上划有一条鼠抗pET32a-VP1cr多克隆抗体检测线(T线)和一条羊抗兔IgG质控线(C线)，底板另一端为吸水纸。当被检样品中带TSV时，TSV首先与胶体金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体形成复合物，在毛细作用下前移至鼠抗pET32a-VP1cr多克隆抗体时被捕捉，即发生双抗夹心特异结合，在检测线处胶体金颗粒富集呈红色，因而可检测样品中是否含有TSV。

近年来，基因编辑技术的出现为其带来了一种更简便灵敏的检测方式，参照Jennifer A.Doudna的文章“Amplification-free detection of SARS-CoV-2 withCRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy”(Cell,Volume 184,Issue 2,21 January2021,Pages 323-333.e9)，该方法利用Cas13a酶在37℃恒温条件下，在无扩增的条件下，利用crRNA的引导与目标序列结合后，激活Cas13a蛋白的附属切割活性，高效切割体系内其它的单链RNA。在体系内加入含有报告基团的单链RNA探针底物后，如果Cas13a识别到靶序列的存在，就会切割单链RNA探针底物从而释放荧光报告基团。该技术具有以下特点：(1)无需扩增，等温检测：试剂盒无扩增需求，且在37℃恒温条件下检测；(2)特异性：本试剂盒含有探针引物，能特异性的结合目标，能有效的避免假阳性现象；(5)灵敏度：本试剂盒能检测到10²copy/μL。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种用于检测桃拉综合征病毒的CRISPR-Cas13a等温检测引物组，及利用该CRISPR-Cas13a等温检测引物组来检测桃拉综合征病毒的方法。