[发明专利]一种改造TK基因5′端序列的重组棒状杆菌及其应用

说明书

本发明涉及一种改造TK基因5′端序列的重组棒状杆菌及其应用。本发明的重组棒状杆菌，是在棒状杆菌宿主菌中，替换TK基因5′端序列中起始密码子TTG前‑92位～‑85位核苷酸序列，降低TK基因5′端序列二级结构的稳定性，使其更易于被转录或表达。该重组棒状杆菌与原始菌株相比，在L‑赖氨酸合成效率上有一定提高，进而提高L‑赖氨酸产量，降低生产成本，而且与现有的高产L‑赖氨酸的改造方法没有冲突，但是与现有的改造方法是否有相互促进的作用，仍需要进一步验证。

技术领域

本发明涉及一种改造TK基因5′端序列的重组棒状杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-赖氨酸是人体必需氨基酸之一，是世界上仅次于味精的第二大氨基酸品种。目前世界L-赖氨酸产品约90％用作饲料添加剂，10％用于食品和药品中间体，我国饲用赖氨酸市场起步于20世纪90年代中期，其原因主要是当时的鱼粉价格昂贵，动物营养学家和饲料企业为降低饲料成本，致力于通过在饲料中添加赖氨酸和蛋氨酸开发无鱼粉日粮，并取得了巨大成功，而且在饲料中的应用越来越广泛。L-赖氨酸最初是从蛋白质水解产物中分离得到的，蛋白质水解法一般以动物血粉为原料，但由于使用剧毒原料光气，可能残留催化剂，产品安全性差，存在严重的环保问题。目前，世界生产赖氨酸的企业大多采用发酵法，生产的为L型赖氨酸，生产工艺已基本成熟。

用于发酵法生产L-赖氨酸的微生物包括多个种属，例如棒状杆菌、芽孢杆菌、埃希氏菌等，但是，野生型菌株产L-赖氨酸的能力差，代谢副产物多，难以实现高纯度和高产量L-赖氨酸的制备。因此，通常需要获得高产L-赖氨酸的菌株。目前，获得高产L-赖氨酸的菌株的方法主要包括诱变筛选育种或者基因工程育种。诱变筛选育种是指通过紫外照射或者其他外界条件刺激，诱导菌株发生不特定的基因位点突变，然后通过筛选获得高产菌株，这种方法缺乏方向性，基因突变位点难以控制，对菌株性能的预期性差。基因工程育种是通过明确的基因改造方式来优化选育菌株，例如通过增加拷贝或者定点突变导入酶活性高的有益酶基因，或者通过敲除不利基因使酶活性/表达消失。目前，谷氨酸棒状杆菌CICC 23604已经被广泛应用于工业发酵生产各类氨基酸，其产品被FDA认证为“generally regardedas safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组谷氨酸棒状杆菌是生产食品安全级L-赖氨酸的有效途径。

基因5′端序列一般是指位于结构基因5′端上游，通常包含有RNA聚合酶识别、结合和起始转录位点的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，其本身不被转录。它的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子一般位于基因5′端序列内部，长度因生物种类而异，一般不超过200bp，是典型的顺式作用元件，与转录因子(反式作用因子)相结合调控基因表达的水平、部位及方式(中国专利文献CN109385424A)。基因5′端序列替换可被用于以特定的方式调节基因的表达，如它们的条件表达或过表达。以PCR为基础的基因靶向，通过同源重组实现开放阅读框(ORF)上游调控序列的染色体整合，可以使基因组发生稳定的改变(中国专利文献CN111655860A)。

虽然目前已有跟多关于提高L-赖氨酸产量的报道，但是开发新的提高L-赖氨酸产量的方法仍然有其必要性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种改造TK基因5′端序列的重组棒状杆菌及其应用。本发明的重组棒状杆菌是通过基因工程改造棒状杆菌宿主菌获得，具体策略为运用基因5′端序列替换的方法替换转酮醇酶(Transketolase，TK)基因5′端部分核苷酸序列，获得高产L-赖氨酸的重组棒状杆菌。

术语说明：

转酮醇酶(Transketolase，TK)：是一种在戊糖磷酸循环以及光合成的还原型戊糖磷酸循环中起着重要作用的酶，广泛存在于细菌、酵母和动物植物中，催化二碳单元在酮糖(供体)和醛糖(受体)间的转移，是平衡细胞中酮糖和醛糖含量的关键酶，有研究结果表明，转酮醇酶表达量提高能增强L-赖氨酸产量。

本发明技术方案如下：