[发明专利]一种热稳定性增强的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体

说明书

本发明公开了一种热稳定性增强的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明公开了以来源于微生物Thermoclostridium caenicola的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶作为亲本，将107位的甘氨酸Gly突变为脯氨酸Pro，155位的苯丙氨酸Phe突变为酪氨酸Tyr，162位的天冬氨酸Asp突变为苏氨酸Thr，70位的丙氨酸Ala突变为脯氨酸Pro，获得单点突变体酶G107P、F155Y、D162T、A70P和四点突变体酶G107P/F155Y/D162T/A70P，热力学和动力学稳定性得到了提高，在工业化制备D‑阿洛酮糖具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性增强的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术

2002年，国际稀少糖协会(ISRS)提出了稀少糖的定义：在自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物。稀少糖由于其能量值低且具有降血糖、降血脂、益生元、免疫调节等多种生理功能，已成为当前研究的热点内容。D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，是目前研究最热的稀少糖，已经被美国FDA确认为普遍公认安全(GRAS)，在医药和食品等领域具有巨大的应用价值和市场前景。D-阿洛酮糖甜度约为蔗糖的70％，但能量值却只有蔗糖的10％，具有较高的溶解度和较低的血糖反应，是理想蔗糖替代品。2019年，FDA宣布允许食品制造商在营养标签的总糖和添加糖计数中可以不计入D-阿洛酮糖(FDA-2019-D-0725)。此外D-阿洛酮糖具有多种独特的营养学和生理学功能，包括：低能量，可预防肥胖；可作为Ⅱ型糖尿病人的辅助治疗剂、膳食补充剂和甜味剂，起到降低血糖的作用；降低血脂，减少脂肪合成酶活性，控制腹腔内脂肪堆积以及抗氧化活性、神经保护等。同时，在食品体系中添加D-阿洛酮糖可以起到提高凝胶性的作用，并且能与食品体系中的蛋白质发生美拉德反应产生良好的化学风味。D-阿洛酮糖可通过化学法合成，但存在许多弊端，例如会产生严重的化学污染，形成不必要的副产物，反应步骤繁琐，反应条件苛刻等。相比于化学合成，具有生态友好性和高度特异性的酶法生物转化是更具优势的D-阿洛酮糖生产策略。

酮糖3-差向异构酶能以唯一底物D-果糖作为原料，通过C-3差向异构化反应，一步法直接生成D-阿洛酮糖，是目前最有可能实现工业化的D-阿洛酮糖制备用酶。然而已鉴定的野生型酶的热稳定性普遍较低，为满足工业化应用的需求，不同属性的酮糖3-差向异构酶的定向挖掘与热稳定性分析以及基于融合标签、定向进化和理性设计的酮糖3-差向异构酶热稳定性分子改造等研究已被广泛开展。随着生物信息学和计算生物学的发展，基于计算机辅助的酶热稳定性分子改造已成为研究热点。根据已有的酮糖3-差向异构酶的晶体结构进行同源建模，借助计算机辅助预测蛋白质折叠自由能变化，理性选取影响热稳定性的突变“热点”，利用定点突变的方法对Thermoclostridium caenicola DAEase进行热稳定性改造，通过加强结构整体刚性、形成亚基间氢键以及优化表面电荷分布，获得热稳定性增强的突变体。

发明内容

[技术问题]

目前，已经报道的D-阿洛酮糖3-差向异构酶有23个，且大多数在60℃下的半衰期低于2h，而工业生产需要较高的温度进行反应。本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性增强的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶。

[技术方案]

为了解决上述存在的技术问题，本发明通过定点突变的办法，对来自微生物Thermoclostridium caenicola的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAEase)进行分子改造。

本发明的第一个目的是提供一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

在一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的野生酶的基础上，将107位的甘氨酸突变为脯氨酸，155位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，162位的天冬氨酸突变为苏氨酸或70位的丙氨酸突变为脯氨酸。