[发明专利]外切酶III驱动的三维DNA纳米机器及其应用

说明书

本申请提供一种外切酶III驱动的三维DNA纳米机器及其应用，所述三维DNA纳米机器，包括信号探针@纳米金结构和检测探针，信号探针中包含信号探针序列和荧光分子，检测探针中包含半胱天冬酶的识别位点和DNA触发链，DNA触发链与信号探针序列互补；检测探针在半胱天冬酶存在下裂解释放出包含DNA触发链的结构，该结构中的DNA触发链与信号探针杂交形成双链DNA，双链DNA可被外切酶III识别并消化，释放出信号探针中的荧光分子，DNA触发链随即恢复单链并继续与其他信号探针杂交，从而实现荧光分子的循环释放。本发明可实现对多种半胱天冬酶活性的的同时检测，且检测灵敏度高，而且还可用于对半胱天冬酶抑制剂的筛选。

技术领域

本申请涉及生物分析技术领域，具体涉及外切酶III驱动的三维DNA纳米机器及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本申请的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种表现形式，可以在不引发任何炎症的情况下导致细胞死亡，半胱天冬酶在细胞凋亡过程中起着关键的调控作用。半胱天冬酶是一种通过裂解一系列下游蛋白最终导致细胞解体的蛋白酶，其活性异常涉及许多人类疾病，比如阿尔茨海默病、贫血、自身免疫性疾病和癌症。

在凋亡相关的半胱天冬酶中，根据其在凋亡级联信号传递过程中所扮演的角色可分为启动子半胱天冬酶和效应子半胱天冬酶。启动子半胱天冬酶负责裂解效应子半胱天冬酶的前体启动凋亡级联反应，而效应子半胱天冬酶可在激活后执行相关下游蛋白的裂解，破坏具有结构功能和调控功能的细胞蛋白，完成细胞凋亡过程。作为启动子的半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9是细胞凋亡信号转导的重要组成部分，因为他们能够激活半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6和半胱天冬酶-7等效应子半胱天冬酶。细胞凋亡共有外源性通路和内源性通路两种调节方式，在细胞凋亡的外源性通路中，死亡受体可特异性激活半胱天冬酶-8；而在细胞凋亡的内源性通路中，线粒体膜电位的改变会引发细胞色素C的富集，进而激活半胱天冬酶-9。因此，同时测定半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9的活性对于临床诊断和生物学研究都具有重要意义。

检测半胱天冬酶的常规方法包括酶联免疫吸附法、蛋白印迹法、流式细胞术和质谱等方法，可用于研究其在凋亡机制中的作用。然而这些方法大多存在步骤繁琐、耗时长、实验前需要样品预处理等问题，因此并不适合快速检测。近几年来，基于电化学检测、比色检测和荧光检测等技术的新方法逐渐发展起来，可用于在体内和体外检测半胱天冬酶，在这些方法中，大部分都是基于抗体识别或多肽裂解的原理。基于抗体的免疫印迹法可以在同一样品中同时比较不同的半胱天冬酶，但需要高质量的抗体。多肽和抗体相比具有易获取、成本低、结构简单、化学性质稳定等显著优势，但由于背景荧光干扰以及可能的光谱重叠等问题，这类基于多肽裂解的检测方法的灵敏度受到限制。因此，开发新型的生物传感器来灵敏地检测半光天冬蛋白酶活性仍具有非常大的挑战。

发明内容

半胱天冬酶是细胞凋亡的主要执行者，启动子半胱天冬酶是细胞凋亡信号转导的重要组成部分，可在凋亡的外源性通路和内源性通路中激活效应子半胱天冬酶。同时检测多种启动子半胱天冬酶对于细胞凋亡机制的研究和疾病治疗至关重要。然而，现有的检测方法存在操作繁琐、背景信号高、灵敏度较差等局限性。为了改善现有技术的不足，本发明提供了一种外切酶III驱动的三维DNA纳米机器，及包含该三维DNA纳米机器的试剂盒，以及将其用于同时检测多种(至少2种)半胱天冬酶中的应用及具体检测时的方法。本发明的方法将外切酶III驱动的三维DNA纳米机器与单分子检测技术相结合，检测背景低、检测灵敏度高、操作简单，恒温条件即可，且适用范围广泛。

具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。