[发明专利]伊短菌素高产工程菌株及其应用

说明书

本发明涉及基因工程和微生物领域，具体公开了伊短菌素高产工程菌及应用。该工程菌以野生型短短芽孢杆菌为原始菌株，将启动子P_grac、P_spc、P_shuttle‑09和P₄₃与抗性基因Apra^R连接，构建同源重组整合载体，利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌中伊短菌素生物合成基因簇的天然启动子P_ede分别替换为启动子P_grac、P_spc、P_shuttle‑09和P₄₃，得到相应的高产伊短菌素的短短芽孢杆菌工程菌。通过所述定向遗传修饰的短短芽孢杆菌工程菌能够提高伊短菌素的产量，培养方式简单、生产效率高，为实现伊短菌素在微生物源农药和医药中的开发与利用奠定了坚实的基础。

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物领域，具体涉及伊短菌素高产工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

据统计，国际上生物农药类产品己经高达100多种，其中90％以上的有效成分是芽孢杆菌或其代谢产物。芽孢杆菌制剂除了能够防治虫害，还能够抑制或杀死病原菌，保护作物免受病原菌的危害。

伊短菌素(edeines)是由短短芽孢杆菌( Brevibacillus brevis)产生的线性非核糖体类抑菌活性物质。Edeines由四种非蛋白氨基酸残基(β-Tyr/β-Phe、Isoserine、DAPA和DAHAA)、一个甘氨酸和一个聚胺组成，依其序列差异，可分为edeine A、B、D和F四种组分，各组分又有α（1）和β（2）两种同分异构体，区别在于β-异丝氨酸（Isoserine）中的羧基跟2,3-二氨基丙酸（DAPA）中的α位氨基还是β位氨基形成肽键。伊短菌素对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性菌、支原体和真菌等微生物具有广谱抑菌活性；此外，对肿瘤细胞也有抑制效果，而且还具有免疫抑制活性。正因为如此，伊短菌素具有开发为农用或医用抗生素的良好潜力。

然而，在野生型短短芽孢杆菌中伊短菌素的产量较低，极大地阻碍了伊短菌素作为微生物源农药或生物医药的开发与应用。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供伊短菌素高产工程菌及其制备方法和应用，该工程菌通过对短短芽孢杆菌进行定向遗传修饰，有效提高伊短菌素的产量。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种伊短菌素高产工程菌，其是利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌( Brevibacillus brevis)中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子P_ede替换为P_grac、P_spc、P_shuttle-09和P₄₃而得到的。

在具体实施方式中，所述启动子Pgrac的核苷酸序列GeneBank登录号为MH328010.1；启动子Pshuttle-09的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；启动子Pspc的核苷酸序列GeneBank登录号为EU864235.1；启动子P43的核苷酸序列GeneBank登录号为DQ264732.1。

本发明还提供所述的伊短菌素高产工程菌的制备方法，其特征在于，将启动子P_grac、P_spc、P_shuttle-09或P₄₃与抗性基因连接获得的融合片段，构建同源重组整合载体，利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子P_ede替换为P_grac、P_spc、P_shuttle-09和P₄₃得到相应的短短芽孢杆菌工程菌。