[发明专利]基于片段化酶的DNA文库制备方法

说明书

本发明提供了一种新型片段化酶，可以高效将基因组随机打断成50～150bp左右的片段。本发明还提供了一种一步法快速DNA文库的建库方法。其中，该建库方法包括：将DNA(基因组或其它大片段dsDNA序列)进行片段化、末端加A及接头连接反应的步骤整合成一步，进行一管式反应，通过纯化、富集，获得DNA文库。本发明的一步法建库方法，能够高效、快速地获得高质量的DNA测序文库。

技术领域

本发明涉及生物测序领域，特别是涉及一种基于片段化酶的DNA文库制备方法。

背景技术

新一代测序(Next-generation sequencing，NGS，又称高通量测序、二代测序)可以一次性测定大量核酸序列，被广泛用于基因组、转录组研究，在医学、法医等领域也有诸多应用。由于其超高的测序能力，在科研和临床中有极为重要的应用。新一代测序技术为科学研究带来了一次革命性的改变。一次几十万到几百万条DNA序列的测序，使得一次对一个物种从DNA到RNA的遗传信息全貌解析成为可能，使人类对自然和自身的认知上升到一个新的层面。随着目前基因测序的测序通量的增多，测序的成本降低，进而被广泛使用。

新一代测序技术的飞速发展，使得测序通量大幅增加，要求上游样本处理尽可能简单快速，以提高NGS整个流程的工作效率。对新一代测序技术而言，文库构建，尤其是DNA文库构建，基本可以分为两步：第一步文库的构建和第二步文库的上机测序。

第一步文库的构建，一般分为DNA的随机打断、末端修复、接头连接、连有接头的DNA片段的PCR扩增、及质控以达到上机的测序要求。具体地，由于Illumina测序策略本身的问题，导致测序长度不能太长，因此将基因组DNA用物理或生物酶法将长片段的基因片段化(打断)；打断后若产生平末端的序列，需要用酶补平；完成补平后，使用酶在3'端加上一个特异的A碱基尾；随后利用互补配对的原则，添加接头序列(一部分是测序时需要的引物序列，另一部分是建库扩增时需要的引物序列)；进行PCR扩增富集，使DNA样品浓度满足上机要求。

第二步针对已构建的文库，使用Illumina、Ion Torrent等公司的测序仪进行上机测序。Illumina公司的Hiseq系列测序平台是高通量测序平台的代表之一，承担全球80%以上的核酸测序工作。Illumina新一代测序技术采用边合成边测序的原理，在碱基延伸过程中形成正确的碱基互补配对，根据碱基所携带的不同荧光标记结合荧光检测元件，在碱基延伸过程中对核酸片段进行快速、高通量的测定。

基因组测序之初的关键步骤，是构建测序文库中，核酸样本的准备。测序文库的质量在很大程度上影响测序质量的好坏。文库质量在现有制备方法的不同步骤中会受到不同程度的影响：首先，通过物理或生物酶法片段化基因组中引起的差异；其次，建库过程中的试剂繁多，反应复杂，且对不同的样品，建库结果存在明显的区别；最后，文库构建过程中繁琐的操作步骤和漫长的反应时间，影响文库的质量。

综上所述，本领域需要开发一种高效快速、易于操作、步骤简单的测序建库方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效快速、易于操作、步骤简单的测序建库方法。

本发明的目的是提供一种一步法快速制备DNA文库的方法及其应用。在本发明的第一方面，提供了一种片段化酶，所述的片段化酶为H1组蛋白元件和FokI蛋白元件融合形成的融合蛋白，所述融合蛋白具有式I或II结构：

Z0―L1―Z1―L2―Z2 (I)

Z0―L1―Z2―L2―Z1 (II)

式中，

Z0为无，或者选自：信号肽、标签序列、或其组合；

Z1为H1组蛋白元件；

Z2为FokI蛋白元件；

L1为无或接头序列；