[发明专利]一种胰岛细胞的冻存方法、复苏方法及重构方法

说明书

本发明公开一种胰岛细胞的冻存方法、复苏方法及重构方法。本发明先将胰岛解离成胰岛单细胞，对胰岛单细胞进行冻存，从而解决胰岛不易冻存的问题，对冻存的胰岛单细胞复苏后与人间充质干细胞共同培养重构成重构细胞团。本发明中的胰岛细胞重构的方法，能够使冻存的胰岛单细胞复苏后快速重构成细胞团，成团率高(最高能达100％)，重复性好；重构得到的胰岛细胞团呈球形，实心，直径在100μm‑750μm，相当于由5‑30层细胞构成；重构得到的胰岛细胞团在体外培养能够对葡萄糖刺激产生应答。在移植裸鼠的血糖水平检测中，重构细胞团具有与胰岛相当的血糖调节功能。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种胰岛细胞的冻存方法、复苏方法及重构方法。

背景技术

胰岛细胞移植是根治1型糖尿病的最有前景的手段。胰岛主要是从胰腺供体中分离纯化得来。胰腺经过合适浓度的胶原酶溶液处理后，胰腺中的外分泌细胞和结构成分会被消解分散开来，胰岛就会被释放到胰腺消化组织液中，再经过细胞分离液密度梯度离心法处理，可以得到纯化后的胰岛。纯化后的胰岛移植到1型糖尿病患者肝脏血管内，能够生理性调控患者的血糖变化。人胰岛(胰岛)的来源有限，主要靠死者的捐献，并且捐献者的身体素质也极大的决定了胰岛在临床上运用的可能性。

胰岛在体外长期培养会影响它的功能。体外培养的时间越长，移植后调节血糖变化的效果越差。一般胰岛分离后，体外培养不超过24小时。因此，胰腺捐献者与胰岛移植受体间的时间和空间差异也显著限制了胰岛移植的临床运用。

胰岛的冻存技术还不成熟。胰岛主要是由四类细胞构成的细胞团，即分泌胰高血糖素的α细胞，分泌胰岛素的β细胞，分泌生长抑素的δ细胞以及分泌胰多肽的PP细胞。其中大多数细胞是β细胞，占60％-80％；α细胞占24％-40％，δ细胞占6-15％，最少的是PP细胞，约1％。这四类细胞不是简单的堆积在一块形成细胞团，而是相互作用从而达到精准调控血糖的变化。目前的细胞冻存技术还不能使胰岛冻存达到临床上移植的质量要求。胰岛单细胞是通过使用解离酶(如胰酶等)打开胰岛细胞之间的紧密联系而获取得到的。这种酶解作用破坏了胰岛细胞的相互作用，直接损伤了胰岛细胞对葡萄糖的应答。因此单纯的胰岛单细胞(即α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞没有成为细胞团)没有或者仅具有微弱的血糖调节能力。鉴于此，有必要开发一套胰岛单细胞冻存、重构的方法。

因此，现有技术存在缺陷，需要改进。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种胰岛细胞的冻存方法、复苏方法及重构方法，解决胰岛细胞冻存及复苏的问题，解决胰岛单细胞重构为具有功能的细胞团的技术问题。

本发明的技术方案如下：提供一种胰岛细胞的冻存方法，包括以下步骤。

S1：取适量纯化后胰岛，也即胰腺纯化后得到的细胞团。

S2：用平衡盐溶液对过滤纯化后胰岛进行清洗，并离心弃除上清液，获得沉淀胰岛。

S3：加入细胞解离试剂重悬沉淀胰岛，并置于37℃环境中孵育5-60分钟，使沉淀胰岛解离成胰岛单细胞，获得胰岛单细胞悬液。

S4：向胰岛单细胞悬液中加入胰岛细胞培养基终止解离，离心并弃除上清液，获得沉淀胰岛单细胞。

S5：胰岛细胞培养基对沉淀胰岛单细胞进行清洗，离心并弃除上清液，获得存储胰岛单细胞。

S6：加入细胞冻存液重悬存储胰岛单细胞，获得存储胰岛单细胞悬液，将分装至细胞冻存管内。

S7：将装有存储胰岛单细胞悬液的细胞冻存管在液氮中进行冻存。