[发明专利]一种胰岛细胞的冻存方法、复苏方法及重构方法

权利要求书

1.一种胰岛细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：取适量纯化后胰岛；

S2：用平衡盐溶液对纯化后胰岛进行清洗，并离心弃除上清液，获得沉淀胰岛；

S3：加入细胞解离试剂重悬沉淀胰岛，并置于37℃环境中孵育5-60分钟，使沉淀胰岛解离成胰岛单细胞，获得胰岛单细胞悬液；

S4：向胰岛单细胞悬液中加入胰岛细胞培养基终止解离，离心并弃除上清液，获得沉淀胰岛单细胞；

S5：胰岛细胞培养基对沉淀胰岛单细胞进行清洗，离心并弃除上清液，获得存储胰岛单细胞；

S6：加入细胞冻存液重悬存储胰岛单细胞，获得存储胰岛单细胞悬液，将分装至细胞冻存管内；

S7：将装有存储胰岛单细胞悬液的细胞冻存管在液氮中进行冻存。

2.根据权利要求1所述的一种胰岛细胞的冻存方法，其特征在于，步骤S1中所述纯化后胰岛预先在5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养6h-36h，然后进行过滤，过滤采用的滤网为200目-400目不锈钢滤网；步骤S3中，所述细胞解离试剂的量为沉淀胰岛体积的5-15倍；步骤S4中，胰岛细胞培养基的量为细胞解离试剂的2-10倍；步骤S6中，分装在细胞冻存管内的存储胰岛单细胞悬液的细胞密度为0.1-10×10⁶/mL。

3.根据权利要求1所述的一种胰岛细胞的冻存方法，其特征在于，所述步骤S7的具体操作为；

S71：将装有存储胰岛单细胞悬液的细胞冻存管装入细胞程序降温盒中并密封；

S72：将细胞程序降温盒放入负80℃环境下中孵育6h-36h；

S73：将细胞程序降温盒内装有存储胰岛单细胞悬液的冻存管转移到液氮罐中储存。

4.根据权利要求1所述的一种胰岛细胞的冻存方法，其特征在于，所述平衡盐溶液为D-hank’s液；所述细胞解离试剂为StemPro^TMAccutase^TMCell Dissociation Reagent；所述胰岛细胞培养基是在F-10培养基中添加以下成分：10mmol/L HEPES、1.2g/L碳酸氢钠、10％v/v胎牛血清、1％v/v青-链霉素；所述细胞冻存液是在所述胰岛细胞培养基中添加以下成分：40％v/v胎牛血清、10％v/v二甲基亚砜、6％m/v羟乙基淀粉。

5.一种复苏方法，其特征在于，包括以下步骤；

SS1：从液氮中取出权利要求1-4任一项所述的装有存储胰岛单细胞悬液的细胞冻存管，于37℃水浴迅速解冻，获得存储胰岛单细胞悬液；

SS2：将存储胰岛单细胞悬液加入至37℃预热过的复苏培养基中，颠倒混匀后，室温静置10-70min，离心弃去上清液，获得复苏胰岛单细胞；所述复苏胰岛培养基为在胰岛细胞培养基中添加以下成分：20-80g/L葡萄糖，10-70g/L牛血清白蛋白；

SS3：向复苏胰岛单细胞中加入胰岛细胞培养基重悬复苏胰岛单细胞，获得复苏胰岛单细胞悬液。

6.根据权利要求5所述的一种复苏方法，其特征在于，在步骤SS2中，所述复苏胰岛培养基的量为存储胰岛单细胞悬液的2-10倍。

7.一种重构方法，其特征在于，包括以下步骤；

SSS1：分别取权利要求5或6所述的复苏胰岛单细胞悬液与间充质干细胞悬液，按任意比混合，并且密度为0.1×10⁵/cm²-10×10⁵/cm²混合均匀，加入到超低吸附细胞培养板中；

SSS2：以胰岛细胞培养基作为培养液进行补充，置于5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养，胰岛单细胞的重构为细胞团。

8.根据权利要求7所述的一种重构方法，其特征在于，在步骤SSS2中，培养时间为12-60小时。