[发明专利]整合有氨基酸氧化酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌

说明书

本发明公开了整合有氨基酸氧化酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌，属于生物工程技术领域。本发明采用合成生物学技术手段多位点多拷贝的将L‑氨基酸氧化酶和葡萄糖脱氢酶基因整合到大肠杆菌染色体，使大肠杆菌具有更好的生长特性，高密度培养的菌株比原始菌株最终量可提高30％以上。将所述工程菌应用于丹参素的生产，丹参素产量可达87.46mM，同时还能够很好地生产羟基酪醇，羟基酪醇产量可达54.43mM。

技术领域

本发明涉及整合有氨基酸氧化酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-氨基酸氧化酶广泛存在于细菌、真菌、哺乳动物细胞、蛇毒、昆虫毒素及藻类中(L-amino acid oxidase as biocatalyst:a dream too far？Appl.Microbiol.Biotechnol.2013,97:9323-41)。绝大部份L-氨基酸氧化酶氧化氨基酸时会产生过氧化氢从而对自身或环境中的细胞产生毒性。自然界中还存在一类不产过氧化氢的氨基酸氧化酶，这些酶来源于变形杆菌属(Proteus sp.)、普罗威登菌属(Providencia sp.)、摩根菌属(Morganella sp.)等。通过相关文献报道这些菌体中的氧化酶从将氨基酸脱氢生成对应酮酸后，电子经过膜呼吸链传递给细胞色素氧化酶，最后与氧结合生成水，这类酶也被称为L-氨基酸脱氢酶或氨基酸脱胺酶。

葡萄糖脱氢酶是短链乙醇脱氢酶家族的一员，在辅酶NAD(P)⁺等存在时能够催化β-D-葡萄糖转化成D-葡萄糖酸内酯，而反应生成的D-葡萄糖酸内酯会自发地进一步水解成葡萄糖酸。目前，葡萄糖脱氢酶按其辅酶种类不同可分为3种：(1)NAD(P)⁺依赖型(EC1.1.1.47)，含这类酶的微生物有Gluconobacter suboxydans,Haloferax mediterranei,Bacillus cereus,Bacillus megaterium,Bacillus subtilis等；(2)FAD⁺依赖型(EC1.1.99.10)，含这类酶的微生物有Aspergillus niger,Burkholderia cepacia等；(3)PQQ依赖型(EC 1.1.5.2)，含这类酶的微生物有Pseudomonas fluorescens,Acinetobactercalcoaceticus,Mythylobacterium extorquens等。FAD⁺依赖型的会产生过氧化氢损伤细胞、PQQ依赖型的效率较低，而NAD(P)⁺依赖型的葡萄糖脱氢酶活性高稳定性好通常为全细胞催化反应提供辅酶再生。

目前利用L-氨基酸氧化酶或葡萄糖脱氢酶来构建的工程菌株通常采用质粒表达系统，而质粒表达系统需要抗生素来维持质粒的稳定性和诱导剂来诱导基因的表达，昂贵的诱导剂增加了生产成本，抗生素和诱导剂的添加也增加了生产的复杂性。因此，为了跨越这些缺陷，构建染色体整合型的工程菌株很有必要(Techniques for chromosomalintegration and expression optimization in Escherichia coli.Biotechnol Bioeng2018,115(10),2467-2478)。

本发明将L-氨基酸氧化酶和基于NAD(P)⁺依赖型的葡萄糖脱氢酶整合到最常用的蛋白表达宿主大肠杆菌上，从而改变大肠杆菌的生长特性，使之具有更强的环境适应能力，更好的应用特性。该菌株具有重要的工业化应用前景。

发明内容

本发明将不产过氧化氢的L-氨基酸氧化酶和葡萄糖脱氢酶整合到最常用的蛋白表达宿主大肠杆菌上，从而改变大肠杆菌的生长特性，使之具有更强的环境适应能力，更好的应用特性。该菌株具有重要的工业化应用前景。

本发明提供一种整合有氨基酸氧化酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌重组菌。同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。