[发明专利]RNA病毒检测方法

说明书

提供一种RNA病毒检测方法。本发明涉及利用逆转录‑聚合酶链式反应(reverse transcription‑polymerase chain reaction、RT‑PCR)检测RNA病毒的方法、以及用于实施该方法的试剂盒。更具体而言，涉及将待检体与包含表面活性剂的待检体处理液混合，进而添加RT‑PCR反应液，从而检测RNA病毒的方法、以及用于实施该方法的试剂盒。

技术领域

本发明涉及利用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerasechain reaction、RT-PCR)检测RNA病毒的方法、以及用于实施该方法的试剂盒。更具体而言，涉及将待检体与包含表面活性剂的待检体处理液混合，进而添加RT-PCR反应液，从而检测RNA病毒的方法、以及用于实施该方法的试剂盒。

背景技术

RNA病毒为具有RNA作为基因组的病毒，被分类为具有由脂质双分子层形成的膜即包膜的冠状病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、登革病毒等、以及不具有包膜的诺如病毒、轮状病毒、鼻病毒等，致病性的RNA病毒也较多。

诺如病毒是属于人杯状病毒(human calicivirus)科的病毒，基因组中具有约7000个碱基的单链RNA。该病毒是按照用电子显微镜观察到的形态学分类也被称为小圆形结构病毒(Small Round Structured Virus,SRSV)、且以诺沃克样病毒(Norwalk-likevirus)这样的属名所称呼的病毒。属于诺如病毒的病毒被分类为基因组(genogroup)(GI)和基因组II(GII)这2种基因组，进而分别被分类为14和17或更多的基因型(genotype)。

人感染诺如病毒时会引起呕吐、痢疾等急性胃肠炎症状。日本国内每年的食物中毒患者的约半数起因于诺如病毒，其中的约7成发生在11月～2月，诺如病毒作为冬季型的胃肠炎和食物中毒的原因病毒而已知。由诺如病毒导致的食物中毒主要由通过烹饪者的食品污染而产生。诺如病毒的感染性强、容易产生大规模的食物中毒等群体事件。对于人的感染途径主要是经口感染。感染者的粪便或呕吐物以及被它们直接或间接地污染的物品类、或者被诺如病毒污染的牡蛎或者其他的双壳贝类等食品类作为代表性的感染源而被列举。因此，鉴定诺如病毒感染患者、由该病毒导致的污染物对于防止病毒感染的扩大是重要的。

作为用于检测由病毒导致的感染、污染的病毒检查，应用检测病毒抗原的免疫学的测定法、病毒基因扩增法(专利文献1～3、非专利文献1)。作为高灵敏度地检测诺如病毒的手段，可列举出用RT-PCR扩增诺如病毒的RNA、测定扩增产物量的方法。例如，根据厚生劳动省药品食品局食品安全部监视安全课的通知(非专利文献2和3)，广泛地利用RT-PCR法进行诺如病毒的检测以及利用实时PCR法进行诺如病毒的定量检测。

RNA病毒粒子具有由RNA基因组与蛋白质形成的核被封入被称为衣壳的蛋白质壳中而成的基本结构。因此，为了利用基因扩增法检测病毒RNA，需要从病毒粒子中提取RNA。为了检测作为待检体的粪便中的诺如病毒，例如，将粪便待检体以5～10％(w/v)的浓度悬浮于蒸馏水或生理盐水中，由其离心上清，使用市售的病毒RNA提取试剂盒(例如，QIAamp(注册商标)Viral RNAMini、QIAGEN公司)提取/纯化RNA(非专利文献2)。然而，在多阶段的RNA提取·纯化操作之后进行RT-PCR的检测过程是复杂的。因此，提出了将粪便悬浮液与待检体处理液混合、进行短时间热处理来去除壳蛋白，使内部的RNA游离，将游离的RNA直接供于RT-PCR的简易的检测法(非专利文献4)。另一方面，为了对粪便悬浮液与待检体处理液的混合物进行热处理，需要做以下的工作：为了防止该混合物的暴沸、蒸发而用盖子对反应容器进行密闭，热处理之后卸下盖子，添加RT-PCR反应液。为了改善这一点，提出了将待检体与胍盐等离液剂混合，不必进行热处理而利用RT-PCR来检测病毒的方法(专利文献4)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2002/029119