[发明专利]一种沙蚕激酶的提取方法

说明书

本发明涉及一种沙蚕激酶的提取方法，包括沙蚕预处理，添加缓冲液匀浆，挤压过滤，酶解及沙蚕激酶活化，高温除杂，混合分级盐析，先用低浓度的混合盐溶液进行盐析去除杂质，再用高浓度的混合盐溶液进行盐析收集富含目标蛋白的沉淀物；将所得沉淀物进行疏水层析和离子层析，超滤浓缩，冷冻干燥，获得高效价纤溶酶。本发明方法可提高进沙蚕组织中沙蚕激酶的盐析溶出程度及沙蚕激酶活化程度，提升了提取产率及产品效价。本发明方法提取率高，适用于工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种沙蚕激酶的制备方法，属于生物制药领域。

背景技术

疣吻沙蚕(俗称禾虫，Tylorrhynehush eterochaetus)，在系统分类上属于无脊椎动物中的环节动物门(Annelida)，多毛纲(Polychaeta)，游走目(Errantia),沙蚕科(Nereidae)，疣吻沙蚕属(Tylorrhynchus)，是一广泛分布于暖温带和亚热带沿海的种，在印度尼西亚、越南、日本及我国南京、上海、福建、广东和广西等都有分布。

全球心脑血管治疗市场仍将保持快速发展的势头，并在全球医药市场上继续占据重要的地位。心脑血管治疗市场的规模及其重要性已经使其成为许多制药公司的一个重要目标，而心血管疾病患者的人数增加正在推动这一市场的发展。心脑血管药在全球范围内是第一大类药，约占药品总规模的20％。无论国内外，心脑血管治疗市场都非常巨大.所以，开发从沙蚕中获得的纤溶酶其溶栓活性不低于蚓激酶活性，它既有直接降解纤维蛋白的作用，又能激活纤溶酶原，间接降解纤维蛋白。与尿激酶相比，沙蚕溶纤酶具有较好的热稳定性，尿激酶在37℃很快失活，故尿激酶不适宜制成口服制剂，只能静脉注射。而沙蚕溶纤酶则可以研制成适宜口服的新型溶栓药物或保健食品，其热稳定性较蚓激酶相对较高。

中国专利CN1234443A公开了一种沙蚕激酶及其提取方法和用途的专利，其在沙蚕中提取沙蚕激酶分子量在25000～55000之间，等电点在3～7之间，但其沙蚕激酶提取率较低，500g沙蚕仅获得约4000～5000U沙蚕激酶。博士论文《一种新型日本刺沙蚕纤溶酶的分离、特性及质量标准》中探索了沙蚕激酶的提取方法，其采用硫酸铵盐析、PhenylSepharose 6FF疏水层析、DEAE Sepharose FF阴离子离子交换层析和Sephacryl S-100HR凝胶过滤层析，获得日本刺沙蚕纤溶酶。该提取方法虽与本发明所采用的沙蚕种类不同，但该方法对沙蚕激酶的提取方法进行了初步探索，对提取方法进行放大处理时，其仍存在，初提取液黏度大，盐析过程中沉淀杂质含量较高及盐用量大，提取产率及效价低的问题。

发明内容

为克服现有沙蚕激酶提取过程中沙蚕激酶初提液黏度大，沙蚕激酶盐析得率低及杂质含量高、产品效价低的问题，本发明对现有提取方法进行改进，提供了一种从沙蚕中提取沙蚕激酶的方法，该方法可提高沙蚕组织中沙蚕激酶的盐析析出程度及沙蚕激酶活化程度，提升了提取产率及产品效价。本发明方法提取率高，适用于工业化生产。

本发明技术方案如下：

一种沙蚕激酶的提取方法，包括如下步骤：

将沙蚕添加预冷的磷酸盐缓冲液后匀浆，挤压过滤，收集滤液；

向所得滤液中加入碱性脂肪酶，保温酶解并使沙蚕激酶活化，制得酶解液；

通常可在酶解后降至常温，过滤得滤液或离心收集上清液，得酶解液；

将所得酶解液于55～60℃高温除杂后，将滤液或离心所得上清液用0.5μm微孔滤膜过滤，收集膜过滤液；

将所得膜过滤液分级盐析，即先用低浓度的混合盐溶液进行盐析去除杂质，再用高浓度的混合盐溶液进行盐析，离心收集沉淀物；

将所得沉淀物依次疏水层析、凝胶过滤除盐层析、离子交换层析，超滤浓缩，冷冻干燥，制得沙蚕激酶。

本发明方法提取所得沙蚕激酶为高效价纤溶酶。