[发明专利]一种沙蚕激酶的提取方法

权利要求书

1.一种沙蚕激酶的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

将沙蚕添加预冷的磷酸盐缓冲液后匀浆，挤压过滤，收集滤液；

向所得滤液中加入碱性脂肪酶，保温酶解并使沙蚕激酶活化，制得酶解液；

酶解后降至常温，过滤得滤液或离心收集上清液，得酶解液；

将所得酶解液于55～60℃高温除杂后，将滤液或离心所得上清液用0.5μm微孔滤膜过滤，收集膜过滤液；

将所得膜过滤液分级盐析，即先用低浓度的混合盐溶液进行盐析去除杂质，再用高浓度的混合盐溶液进行盐析，离心收集沉淀物；

所述用低浓度的混合盐溶液进行盐析去除杂质，其条件为调至盐析溶液中(NH₄)₂SO₄浓度为2.5～3.0g/L，NaCl浓度为7.0～8.0g/L，在温度6～10℃条件下进行搅拌和盐析去除杂质；所述用高浓度的混合盐溶液进行盐析，其条件为调至盐析溶液中(NH₄)₂SO₄ 浓度为7.0～8.0g/L，NaCl浓度为17.0～19.0g/L，在温度6～10℃条件下进行搅拌和盐析，收集沉淀，获得粗制品；

将所得沉淀物依次疏水层析、凝胶过滤除盐层析、离子交换层析，超滤浓缩，冷冻干燥，制得沙蚕激酶；所述沙蚕激酶比活力为5.4～5.9万IU/mg；

所述酶解的条件：采用碱性脂肪酶，酶添加量为沙蚕重量的0.05～0.2％，最适酶解pH为7.0～9.0，酶解温度为30～35℃，酶解时间为2.0～3.0h。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述匀浆采用预冷到8～10℃的pH7.5～8.5，0.14～0.18mM磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述匀浆时间为10～20s；所述磷酸盐缓冲液与沙蚕的比例为2～2.5L/kg。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液与沙蚕的比例为2～2.5L/kg。

5.根据权利要求1、3、4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述疏水层析选用的介质为Butyl Sepharose FF。

6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述疏水层析所用平衡缓冲液为含有1.0M/L(NH₄)₂SO₄的pH7.4 15mM磷酸盐缓冲液；洗脱缓冲液为pH7.4 15mM磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求1、3、4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述凝胶过滤除盐层析选用的介质为Sephadex G-25M。

8.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，所述凝胶过滤除盐所用平衡缓冲液和洗脱缓冲液均为pH7.4 20mM Tris-HCl buffer。

9.根据权利要求1、3、4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述离子交换层析所用介质为DEAE Sepharose FF。

10.根据权利要求9所述的提取方法，其特征在于，所述离子交换层析所用平衡缓冲液为pH7.4，20mM Tris-HCl buffer；洗脱缓冲液为含1.0M/L NaCl的pH7.4 20mM Tris-HClbuffer。

11.根据权利要求1、3、4任一项所述的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取鲜活的疣吻沙蚕(Tylorrhynchus heterochaetus)，饥饿饲养处理后臭氧消毒；

2)将消毒后的沙蚕放入预冷到8～10℃的pH7.5～8.5，0.14～0.16mM磷酸盐缓冲液中，匀浆，挤压过滤，收集滤液；沙蚕与所述磷酸盐缓冲液的比例为10kg/(20～25)L；

3)向所得滤液中加入碱性脂肪酶，于pH7.0～9.0、温度30～35℃条件下，保温酶解2.0～3.0h；酶解后置于4℃条件下离心，收集上清液；碱性脂肪酶添加量为沙蚕重量的0.1％～0.2％；

4)将所得酶解液升温至55～60℃，维持30～50min；然后迅速在冰水中冷却至室温，4℃条件下离心，收集上清液，去除沉淀；将上清液用0.5μm的微孔滤膜过滤，收集膜过滤液；

5)向所得膜过滤液中加入(NH₄)₂SO₄和NaCl，使硫酸铵浓度为2.5～3.0g/L，氯化钠浓度为7.0～8.0g/L，在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h；离心去除沉淀，收集上清液；

向所得上清液中继续加入(NH₄)₂SO₄和NaCl，使硫酸铵浓度为7.0～8.0g/L，氯化钠浓度为17.0～19.0g/L；在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h；离心，弃去上清液，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，备用；

6)疏水层析：采用Butyl Sepharose FF作为疏水介质，平衡缓冲液为含有1.0M/L(NH₄)₂SO₄的pH7.4，15mM磷酸盐缓冲液；洗脱缓冲液为pH7.4，15mM磷酸盐缓冲液；

7)凝胶过滤除盐层析：采用Sephadex G-25M作为介质对步骤6)分离所得组分进行除盐层析；平衡缓冲液和洗脱缓冲液均为pH7.4，20mM Tris-HCl buffer；

8)离子交换层析：采用DEAE Sepharose FF凝胶材料为介质进行子交换层析，平衡缓冲液为pH7.4，20mM Tris-HCl buffer；洗脱缓冲液为含1.0M/L NaCl的pH7.4，20mM/L Tris-HCl buffer；

9)超滤浓缩及冷冻干燥：取纤溶酶活性较高的活性组分进行超滤除盐脱水，脱去小分子物质，直至溶液电导率≤0.2×10³μs/cm；并将澄清液真空冷冻干燥，得到沙蚕激酶冻干粉。