[发明专利]酮基泛解酸内酯还原酶及其应用

说明书

本发明涉及微生物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种全新的源自裂殖酵母的酮基泛解酸内酯还原酶及其应用。所述酮基泛解酸还原酶对酮基泛解酸内酯具有优良的酶活性，可以催化酮基泛解酸内酯不对称还原生成D‑泛解酸内酯。本发明还构建了一菌双酶反应体系，双酶重组细胞诱导产生的酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶偶联，催化底物酮基泛解酸内酯不对称还原生成D‑泛解酸内酯，通过辅底物葡萄糖的脱氢将氧化型辅酶NADP⁺还原成NADPH，从而实现辅酶循环。由于葡萄糖脱氢酶的催化效率远高于酮基泛解酸内酯还原酶，可以促进还原反应高速进行，极大地提高反应效率，降低成本。

技术领域

本发明涉及微生物基因工程技术领域，更具体地，涉及一种源自裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的酮基泛解酸内酯还原酶及其应用。

背景技术

D-泛酸钙又称维生素B5，是辅酶A的组成部分，已经广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等行业。D-泛解酸内酯是合成D-泛酸钙的重要原料。在工业化生产上，先通过化学法合成DL-泛解酸内酯，再利用内酯水解酶选择性水解混旋泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯生成D-泛解酸，接着分离D-泛解酸和L-泛解酸内酯，分离后的D-泛解酸经酸化成环形成D-泛解酸内酯，而L-泛解酸内酯经消旋化后回用。因此，水解酶催化的手性拆分法尽管工艺成熟，但仍然存在步骤较长、酸碱耗用高等问题。鉴于此，开发更为直接、高效、环保的D-泛解酸内酯不对称合成方法替代现有的手性拆分技术将具有重要的应用价值。D-泛解酸内酯可通过氧化还原法不对称合成，该方法包括两种途径，第一种是以混旋的DL-泛解酸内酯为底物，利用立体选择性专一的L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，接着酮基泛解酸内酯在D-酮基泛解酸内酯还原酶催化下不对称生成D-泛解酸内酯；第二种途径也是先以L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，接着酮基泛解酸内酯自发水解形成酮基泛解酸，然后在D-酮基泛解酸还原酶的作用下生成D-泛解酸，接着D-泛解酸在酸的作用下闭环形成D-泛解酸内酯。该过程以第一条通路更为简捷，与现有的水解酶催化通路相比，工艺更为简单，混旋的底物经生物催化直接得到光学纯产物，不需要消旋步骤，也不需要内酯和酸的分离步骤；在基因工程菌内构建辅酶循环系统，可不需要外加辅酶；以基因工程菌作为整细胞催化剂不需要酶的分离纯化步骤。因此，氧化还原酶不对称合成D-泛解酸内酯的方法是一种非常有前景的生物水解酶法替代者。

氧化还原法中酮基泛解酸内酯不对称还原生成D-泛解酸内酯的步骤是其关键步骤之一，D-酮基泛解酸内酯还原酶是催化该反应的关键酶。已有研究报道，从酿酒酵母中克隆表达了2个酮基泛解酸内酯还原酶SceCPR1和SceAKR3C1，其中SceAKR3C1属于醛酮还原酶家族(Zhao M,Gao L,Zhang L,et al.Asymmetric reduction of ketopantolactoneusing a strictly(R)-stereoselective carbonylreductase through efficient NADPHregeneration and the substrate constant-feeding strategy.BiotechnologyLetters,2017,39:1741-1746)。微生物醛酮还原酶是醛酮还原酶家族的主要组成，通常为NADP(H)专一性依赖型，含有高度保守的(α/β)8桶状结构。微生物醛酮还原酶具有来源的丰富性和催化底物的多样性等特性，其作为生物催化剂在酶法合成手性醇方面已有成功的应用。从微生物醛酮还原酶家族中挖掘具有D-酮基泛解酸内酯还原酶活力的酶，是一条可行的策略。

目前，尚未见源自裂殖酵母的醛酮还原酶具有D-酮基泛解酸内酯还原酶活力的报道，也未见裂殖酵母的醛酮还原酶用于D-泛解酸内酯不对称合成的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全新的酮基泛解酸内酯还原酶及其应用。

本发明第一方面，提供分离的酮基泛解酸内酯还原酶，所述酮基泛解酸内酯还原酶来源于裂殖酵母，其氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。