[发明专利]一种获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA和Oligo DNA

说明书

本发明提供了一种以RNA介导的特异性突变FecB基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA和Oligo DNA，能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的系统包括两个sgRNA和三个Oligo DNA序列，其中，两个所述sgRNA为sgRNA_FecB‑1和sgRNA_FecB‑2，为序列表的序列3和4的核苷酸所示的RNA或具有该序列的RNA；三个所述Oligo DNA序列为序列表的序列5、6和7或具有该序列的DNA。本发明提供的sgRNA和Oligo DNA特异性较高且能够精确靶向修饰绵羊FecB基因，实现基因突变；方便了基因编辑后的细胞和个体鉴定。同时能够有效的增加母羊产羔数。

技术领域

本发明属于动物基因工程领域，涉及CRISPR/Cas9技术，具体涉及一种以RNA介导的特异性突变FecB基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA和Oligo DNA。

背景技术

绵羊的繁殖性能对养羊业具有十分重要的济价值的数量性状，对绵羊产羔数的选择不仅受到性别和年龄的限制，且绵羊产羔数是一个遗传力很低的数量性状，遗传力只有0.1左右，因此很难用常规的育种技术来改良产羔数性状。FecB（fecudity booroola）是在布鲁拉美利奴（Booroola Merino）绵羊中发现的能增加排卵数和产羔数的一个常染色体突变基因，是在绵羊中识别出的第一个高繁殖力主效基因。FecB基因被定位到绵羊6号染色体上对应于人染色体4q22-23的区间，BMPR-IB基因位于该区间。在绵羊体内，BMPR-IB基因主要在生殖器官表达，原位杂交研究发现该基因在卵母细胞和颗粒细胞中特异表达。FecB基因A746G导致该基因蛋白质第249位的谷氨酰胺（Q）突变为精氨酸（R），显著增加绵羊的产羔性能。携带一个FecB 基因突变拷贝的母羊产羔数增加0.9～1.2只, 携带2个突变拷贝的母羊产羔数增加1.1～1.7 只，该基因对排卵数是呈加性效应的，是目前分子标记选育多胎绵羊品系的主效基因。FecB 基因最明显的生理效应是增加卵巢中的卵泡数和排卵数，但纯合子（BB）母羊和杂合子（B+）母羊的成熟卵泡和排出的卵泡直径要比非携带者（++）母羊卵泡直径小。尽管FecB基因可以增加排卵数，但其作用机制尚不完全清楚，研究发现 FecB 基因携带者和非携带者在表型上完全一致，发情周期长短一致，从发情到排卵的 LH 高峰间隔时间也无差别，但FSH浓度有显著差异，而且 FecB 基因携带者睾酮水平相对较高等特点。

近年来，科学家们发明了基于CRISPR/Cas9的基因组编辑新技术，不仅大大降低了对动物进行基因敲除、基因修饰的难度，更是将动物转基因技术由传统的随机整合推向了高度精确的基因组定向删除、突变或插入，开创了转基因动物生产的新时代。CRISPR/Cas9系统是一个由核酸和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，它对靶点的识别依赖于核酸对核酸的识别，通过碱基的互补配对完成。

由于CRISPR/Cas9系统中发挥活性作用的核心部件为sgRNA和蛋白质，因此可以通过体外合成RNA后，显微注射动物受精卵，形成易整合位点，导入特异DNA片段形成突变位点，从而获得打靶动物，同时引入同义突变，制造新的酶切位点，便于后续检测。由于mRNA和蛋白质的不稳定性，不会长期存在生物体内，也不会对环境产生进一步影响，因而可以避免传统转基因导致的生物安全问题，导入的DNA片段与受体物种本身同源，同样不会引起生物安全问题。所以，在目前动植物新品种培育，尤其是基因修饰动物的制备中，CRISPR/Cas9介导的打靶系统被研究者广为采用。

发明内容

要解决的技术问题：本发明的目的是提供一种以RNA介导的特异性突变FecB基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA和Oligo DNA。