[发明专利]一种高纯度门冬酰胺酶的制备方法

说明书

本发明提供了一种高纯度门冬酰胺酶的制备方法。具体而言，该方法包括门冬酰胺酶溶液经阴离子层析柱、阳离子层析柱纯化的步骤，所得门冬酰胺酶纯度在99％以上，每1单位门冬酰胺酶中含内毒素的量小于0.015EU。本发明所述的制备工艺操作简单，回收率高，成本低，工艺衔接性好，适合工业化生产。

技术领域

本发明提供了一种高纯度门冬酰胺酶的制备纯化方法，属于生物工程领域。

技术背景

L-门冬酰胺酶(L-Asparaginase，L-ASP)，又名L-天冬酰胺酶或L-天门冬酰胺酶，商品名为左旋门冬酰胺酶，是一种重要的抗肿瘤药物。目前在临床上可用于治疗儿童急性淋巴细胞白血病(Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病及非霍奇金病淋巴瘤、黑色素瘤等，其中对ALL的诱导缓解期疗效最好。L-ASP单独使用对ALL的有效率为60％；与长春碱(Vincristine)及皮质留类药物(Corticosteroids)等药物联合使用时，对ALL的有效率高达95％，是临床治疗白血病的重要药物。

生产L-门冬酰胺酶的方法常采用大肠杆菌发酵技术，即通过发酵培养获得大量的菌体，通过破菌、提纯后获得高纯度的L-门冬酰胺酶。CN101063118B报道了一种纯化L-门冬酰胺酶的方法，包括通过溶菌酶破菌，利用MnCl₂，硫酸铵两步分级沉淀后，透析脱盐，乙醇三步分级沉淀，再进行离子交换层析、疏水层析，浓缩脱盐，除菌及冷冻干燥的步骤。此方法存在诸多生产操作的不便，如1)工艺中使用了大量有机溶剂乙醇，放大生产时还需对车间加装防爆设施，增加建设成本；2)多次沉淀、复溶及脱盐，工艺繁杂，效率低下，工艺放大困难；3)纯化工艺繁琐，操作时间长势必影响溶液中门冬酰胺酶的稳定性。

CN101831417A报道了一种L-门冬酰胺酶的制备方法：酶破菌—阳离子层析—亲和层析。但此方法中CM-纤维素阳离子填料分离度较差，不利于门冬酰胺酶的纯化，所用亲和填料的配基易于脱落，也会影响所得门冬酰胺酶质量。另外，亲和填料市售价格偏高，必然无形增加生产纯化成本。

因此，技术人员迫切需要开发一种回收率高、衔接性好，同时能够工业化大规模生产高纯度的门冬酰胺酶的方法。

发明内容

本发明提供了一种制备门冬酰胺酶的方法，该方法包括：将门冬酰胺酶溶液经阴离子层析柱纯化的步骤，其中，所述阴离子层析柱填料选自Capto Q ImpRes填料、QSepharose XL填料或Diamond Q Mustang填料，优选Diamond Q Mustang填料；所述所述阳离子层析柱填料选自Capto SPImpRes填料、Diamond SP Mustang填料或SP Sepharose FF填料，优选Capto SPImpRes填料。

在一些实施方案中，用缓冲液洗脱阴离子层析柱，所述缓冲液pH为7.0～9.0，可以为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0，以防止洗脱过程由于层析柱pH急剧变化而导致门冬酰胺酶的聚集变质；所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液(如，磷酸二氢钠-磷酸氢二钠组合、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾组合，等等)、三羟基氨基甲烷盐缓冲液(如，三羟甲基氨基甲烷-盐酸组合，等等)、甘氨酸盐缓冲液(如，甘氨酸-氢氧化钠组合，等等)、铵盐缓冲液(如，氯化铵-氨水组合，等等)，优选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液或氯化铵-氨水缓冲液，更优选三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液。