[发明专利]一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法

说明书

本发明公开了一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法，本方法一对用于重叠延伸PCR的全长扩增的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。本发明通过一次PCR将不连续的位点连接成一条DNA片段，对这条包含多个检测位点所在片段，可以一次性进行Sanger测序分析，利用本发明可以将任意的2～4个包含各自检测位点的片段拼接连接形成融合片段，快速、简单，不需要限制性内切酶，中间无任何非目的基因的DNA序列，进而检测的检测突破了Sanger测序读长的限制，可以通过一个Sanger测序反应同时检测多个不连续的DNA位点。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，更具体地，涉及一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法。

背景技术

一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是利用双脱氧核糖核苷酸在脱氧核糖碳骨架上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，用双脱氧核糖核苷酸当作链终止试剂，测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物，延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP(双脱氧核糖核苷酸并标记不同的荧光标记)中的一种来进行终止，最终产生一系列大小不同的分子，读取这些分子荧光信号的类别和顺序即可获得序列信息。因此一代测序技术由于其准确性好，操作越来越简便等优势，已在遗传病或者肿瘤等方面的检测得到非常广泛的应用。另一方面，由于测序成本相对较高，且测序长度在800bp左右，因此在检测不连续多位点或者多个相隔较远的位点时，往往需要分开单独扩增各个位点，并分开测序，造成成本和操作复杂度的增加。

重叠延伸PCR技术(splicing by overlapping extension PCR，SOE PCR)是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的新技术(图1)。该技术可以快速获取依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其成功的关键是重叠互补引物的设计。SOE PCR在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。此技术可以将任意的两个目的基因拼接连接形成2个目的基因的融合基因，中间无任何非目的基因的DNA序列，这样就避免因加入连接序列可能出现的非目的基因序列，从而在体外就可得到高质量的目的基因序列。

目前的重叠延伸PCR技术，一般包括两次PCR反应，第一次PCR形成具有重叠区域的DNA片段，回收产物；在第二次PCR中，将第一轮PCR的回收产物具有重叠区域的位置互补结合，由两侧的引物共同引导目的DNA片段的合成，不需要限制性内切酶即可以进行片段连接。

至今为止，市场上用于一代测序的技术，尚未出现一种复合定向延伸多DNA片段并测序的PCR技术。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种测序检测不连续多位点的方法。

本发明的第一个目的是一对用于重叠延伸PCR的通用全长扩增的引物。

本发明的第二个目的是一种用于重叠延伸PCR的引物组合。

本发明的第三个目的是所述引物或所述引物组合在多DNA片段PCR扩增、多DNA片段PCR扩增试剂盒、多DNA片段位点检测或多DNA片段位点检测试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是一种多DNA片段PCR扩增的方法。

本发明的第五个目的是一种多DNA片段PCR扩增的试剂盒。

本发明的第六个目的是一种多DNA片段位点检测的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：