[发明专利]原代肿瘤细胞培养基、培养方法以及应用

说明书

本发明属于医药技术领域，具体为一种原代肿瘤细胞培养基、培养方法以及应用。本发明的原代肿瘤细胞培养方法包括：配置原代细胞培养基，其组分包含：氢化可的松，EGF，Insulin，ROCK抑制剂，但不包含霍乱毒素，是对已有原代细胞培养基的改进；使用上述原代细胞培养基在铺好滋养层细胞上培养肿瘤组织上皮细胞，肿瘤组织上皮细胞在滋养层细胞所分泌的生长因子及培养基中所含营养因子的共同作用下快速增殖，待肿瘤组织上皮细胞长至80%~90%左右的细胞密度时进行消化传代。本发明利用便捷的原代细胞培养方法，得到拥有病人自身肿瘤生物学特性的永生细胞，解决了肿瘤细胞的原代培养永生化的问题，从而实现对患者的个性化治疗。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种原代肿瘤上皮细胞培养及药物评估的方法，包括原代肿瘤上皮细胞培养基，培养方法，以及药物评估的方法。

背景技术

近年来，随着筛检技术、手术技术的逐步发展以及规范化的放化疗技术的应用，癌症的临床预防及治疗水平已经有了较大的进步，但是很多进展期癌症的五年生存率并没有得到明显的提高。其原因主要在于临床化疗药物的疗效非常有限，由于不同癌症患者肿瘤的进展程度，基因突变，生物学特性，耐药性及异质性均不完全相同，故其对临床上化疗药物的敏感程度不同，患者应用临床一线药物的应答率及有效率也不理想。因此，临床上针对不同患者均使用相同药物会带来不必要的治疗，导致患者的痛苦及医疗资源的浪费。

如何评价化疗药物对不同肿瘤患者的有效性成为了一个重要的研究方向，即所谓的个体化治疗。目前现有的临床评价药物的模型主要为来源于人体新鲜肿瘤的动物移植模型( patient-derived tumor xenograft models，PDX)，即将病人新鲜的瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠（裸鼠）体内而建立的肿瘤模型。在多种类型肿瘤的PDX移植模型的检测中，裸鼠移植瘤保持了患者肿瘤的生物学特征，同时也具有患者肿瘤的遗传多样性，在抗肿瘤药物研究和基础机制研究中起到了重要意义。但是PDX 模型建模时间长，成本过大，有免疫微环境的缺失，成功率近为25%左右，难以大规模应用于临床造福患者。

肿瘤原代细胞培养一直是临床评价药物的一种重要方法，但是由于不同肿瘤组织的建系难度及成功率不一，故一直难以形成稳定的方法。经过了长期探索和研究，我们发现使用滋养层细胞的条件性重编程培养法（conditional reprogramming culture，CRC）可以快速稳定建立原代肿瘤细胞系。且由于肺癌和膀胱癌的特殊性，其患者胸水或尿液中会有一定量的肿瘤上皮细胞，故可以利用这些肿瘤细胞进行便捷的原代细胞培养，一方面提高液体活检的准确性，另一方面通过药物评估进行患者的个体化治疗。

发明内容

本发明的的目的在于提供一种快速、稳定的原代肿瘤细胞的培养方法，并进一步对癌症患者进行个性化药物评估和筛选。

本发明提供的原代肿瘤细胞的培养方法，具体步骤为：

（1）配置原代细胞培养基：其组分包含：氢化可的松，EGF（表皮生长因子），Insulin（胰岛素），ROCK抑制剂（RhoA激酶抑制剂）；但不包含霍乱毒素（参见Nature protocol中的文章：Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumorcells from human biospecimens.其包括霍乱毒素），是对已有原代细胞培养基的改进；所述培养基简称完全F培养基（记为Complete F），培养基于35℃-38℃，3%-10% CO₂（最优条件为37℃，5% CO₂）条件下培养待用；

（2）铺好滋养层细胞；

（3）取肿瘤组织上皮细胞；

（4）使用上述原代细胞培养基在铺好滋养层细胞上培养肿瘤组织上皮细胞：