[发明专利]原代肿瘤细胞培养基、培养方法以及应用

权利要求书

1.一种原代肿瘤细胞的培养方法，其特征在于，具体步骤为：

（1）：配置原代细胞培养基：其组分包含：氢化可的松，EGF，Insulin，ROCK抑制剂；所述培养基简称完全F培养基，记为Complete F；

（2）：铺好滋养层细胞；

（3）：取肿瘤组织上皮细胞；

（4）：使用上述原代细胞培养基在铺好滋养层细胞上培养肿瘤组织上皮细胞：

将肿瘤组织上皮细胞铺于已准备好的滋养层细胞上，用Complete F培养基在35℃-38℃，3%-10% CO₂条件下进行培养；根据肿瘤组织上皮细胞的量选择合适大小的培养皿和适量Complete F培养基；肿瘤组织上皮细胞在滋养层细胞所分泌的生长因子及培养基中所含营养因子的共同作用下快速增殖，待肿瘤组织上皮细胞长至80%~90%的细胞密度时进行消化传代；

所述原代细胞培养基中：

所述氢化可的松的含量为：10 ng/ml~40 ng/ml；

所述EGF的含量为：0.05 ng/ml~0.175 ng/ml；

所述insulin的含量为：2.5 μg/ml~7.5 μg/ml；

所述ROCK抑制剂的含量为：5 μM~15 μM；

所述ROCK抑制剂是选自Y-27632；

所述的肿瘤为膀胱癌；所述肿瘤上皮细胞，是从膀胱癌患者的尿液中分离获得。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述滋养层细胞为NIH/3T3小鼠胚胎成纤维细胞或人的成纤维细胞。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，肿瘤上皮细胞分离过程是：清洁环境下，收集膀胱癌患者的尿液于无菌离心管内，800-1200rpm离心8--12 min；用添加0.8—1.2%的青霉素-链霉素双抗的PBS进行重悬，再次离心，重复两次后得到的肿瘤上皮细胞用培养基重悬，得到原代细胞悬液。

4.由权利要求1-3之一所述的培养方法得到的原代肿瘤细胞在临床药物的疗效评估和筛选中用途，通过鉴定原代肿瘤细胞来源及属性，进行临床药物的疗效评估和筛选，具体步骤如下：

（1）根据患者具体情况选择所需检测的药物，通过预实验进行药物浓度的确定；

（2）每个药物以预实验所确定的药物浓度为参考，前后稀释8-12个不同的浓度，依次5-10倍稀释，对照组为DMSO；

（3）将所培养的原代细胞消化铺板，铺于96孔板内，每孔3000~5000个细胞，加95µLComplete F培养基，置于孵箱中进行过夜贴壁；

（4）第二天将梯度稀释的药物加于细胞内；

（5）加药处理三天后，进行Alamar Blue检测，向每孔加入10µL Alamar Blue，37℃孵育3.5-4 h，之后用荧光酶标仪测量各孔的荧光强度，根据测得的数值，以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，应用GraphPad Prism 5软件绘制药物剂量反应曲线，计算各个药物对所测试细胞的50%抑制浓度。