[发明专利]提取外泌体及外泌体蛋白的方法

说明书

本发明公开了从人体体液或者细胞的培养液中提取外泌体及外泌体蛋白的方法。本发明提供的提取外泌体及外泌体蛋白的方法包括：向含有外泌体的待提取液中加入提取材料提取得到外泌体；提取材料为金属氧化物或修饰有所述金属氧化物的功能材料；金属氧化物能与磷酸根离子发生双配位作用；所述待提取液为来源于人体的体液、所述体液的稀释液或细胞的培养产物。实验证明，本发明的外泌体提取方法可以实现对人体体液或细胞的培养液中外泌体的高效提取，提取时间短，获得的外泌体纯度高，可以通过洗脱液洗脱获得完整的外泌体，并且所用提取材料可回收重复利用；另外提取所得外泌体蛋白可发现，所得外泌体蛋白种类多且与外泌体功能更密切。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，从人体体液或者细胞的培养液中提取外泌体及外泌体蛋白的方法。

背景技术

外泌体是哺乳动物细胞通过“内吞-外排”过程分泌到细胞外的一类囊泡状结构，直径约为30-150nm。外泌体不仅存在于细胞培养液中，也存在于血液、尿液、羊水、母乳、精液、唾液、胸腔积液等体液中，其组成包括脂质双分子层以及细胞来源相关的蛋白质、RNA、DNA等物质。几乎所有的细胞都可以产生外泌体，不同细胞来源的外泌体中既包含与细胞形成、结构和物质转运相关的共有成分，也包含与来源细胞的生物功能相关的特异分子。外泌体作为一种细胞间交流、传递大量的生物功能分子的重要方式日益受到重视。研究表明，外泌体在一系列生理和病理过程中起到至关重要的作用。肿瘤相关外泌体能够诱导癌症发生、参与肿瘤靶向转移、改善肿瘤生长的微环境、抑制免疫系统对肿瘤的免疫监督以及介导肿瘤细胞抗药性，对肿瘤外泌体的分析和检测有利于肿瘤的早期诊断、预后分析和疗效评价。

目前常用的外泌体提取方法包括超速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法、超滤法、体积排阻色谱、免疫亲和法。前四种方法基于外泌体独特的密度、尺寸等物理学参数实现提取，缺乏特异性，不能满足实际样本中肿瘤细胞外泌体特异性提取和分析的要求。尤其人体体液样本中，含有大量的低密度脂蛋白及乳糜微粒等微粒，这些微粒的粒径和密度与外泌体接近，绝大部分方法无法将其与外泌体分离开，从而对外泌体的后续分析造成干扰。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提取外泌体。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了外泌体的提取方法，所述方法包括：向含有外泌体的待提取液中加入提取材料提取得到外泌体；所述提取材料为金属氧化物或修饰有所述金属氧化物的功能材料；

所述金属氧化物能与磷酸根离子发生双配位作用。

上述方法中，所述金属氧化物可为TiO₂、ZrO₂、Al(OH)₃、Ga₂O₃、Fe₃O₄、Fe₂O₃、Nb₂O₃、SnO₂、HfO₂和/或Ta₂O₅；

所述修饰有所述金属氧化物的功能材料具体可为修饰有所述金属氧化物的氧化石墨烯、磁性纳米颗粒或硅球。

所述材料的粒径可为1～50μm。

上述方法中，所述待提取液可为来源于人体的体液、所述体液的稀释液或细胞的培养产物。

所述体液的稀释液可通过将所述体液利用缓冲液进行稀释得到。所述缓冲液可为具有pH缓冲能力且能够维持外泌体渗透压的溶液。所述缓冲液具体可为DMEM缓冲液(Gibico公司，货号31053-028)、HEPS(溶剂为水，溶质及其浓度分别为50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和150Mm NaCl，pH 8)或PBS(Corning公司，货号：21-040-CVR)。将所述体液利用缓冲液进行稀释时所述体液和所述缓冲液的体积比可为1:1～1:5。将所述体液利用缓冲液进行稀释时所述体液和所述缓冲液的体积比进一步可为1:1。