[发明专利]一种检测自闭症相关基因UBE3A拷贝数的试剂和方法

说明书

本发明提供了一种检测自闭症相关基因UBE3A拷贝数的试剂和方法。具体地，本发明提供了一种检测UBE3A拷贝数的引物和探针组合，以及利用该引物和探针进行检测的方法，本发明还提供了包含该引物和探针的试剂盒。本发明特异性强、灵敏度高、简便、快速，可作为自闭症的分子诊断标记，同时为自闭症靶向药物的开发和应用提供重要的疾病分型依据。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，更具体地涉及一种检测自闭症相关基因UBE3A 拷贝数的试剂和方法。

背景技术

自闭症谱系障碍是一种致病原因多样化的广泛性神经发育障碍型疾病，其 核心症状主要体现在社会交往、沟通能力的缺陷，局限重复性兴趣、行为或活 动等方面。据美国疾控中心(CDC)2012年统计数字，新生儿的自闭症发病率 已达到1/68，并且呈现逐年上升的趋势。迄今为止，引起自闭症的遗传因素包 括基因点突变和染色体拷贝数变异，它们的突变涵括多种受累基因，涉及不同 的信号通路。在自闭症病例中，母本染色体15q11-q13拷贝数的扩增大约占到 1-3％。其中在对多人群病例的研究中发现，UBE3A的过度激活是自闭症亚型中 阐述最为清楚的致病因素。发明人目前的临床前研究证实，UBE3A过度激活通 过负调控维甲酸RA信号通路来诱导自闭症表型的发生。因此，对人UBE3A基因 拷贝数进行相对定量检测，无论是对临床自闭症相关疾病的辅助诊断或是对新 生儿UBE3A基因相关的出生缺陷预防都是具有参考价值的指标之一。

拷贝数变异(Copy Number Variation，CNV)是基因组DNA发生的变异， 涉及的基因组序列长度从1kb到1Mb，包括拷贝数增加和拷贝数减少两类。人是 二倍体生物，正常人细胞中2条同源染色体上各有一个正常的UBE3A基因，即每 个正常细胞有2份UBE3A基因。临床表明UBE3A过度激活的自闭症患者中，UBE3A 的拷贝数会超过正常2份，最常见的是3份和4份拷贝，甚至更多。因此鉴定与 自闭症相关的UBE3A CNV信息对疾病的筛选、诊断、分型和对应的精准治疗至 关重要，具有重大的应用价值。

目前临床上尚无方便、可靠的针对UBE3A基因拷贝数相对定量的检测方法。 临床上检测CNV的辅助检测技术主要包括：1.比较基因组杂交芯片(aCGH)， 该技术是利用杂交芯片对未知样品与对照样品的基因组进行对比，此方法只适 合检测Mb水平的CNV，而自闭症中15q11-q13的小片段不能很好的检出，此外该 技术操作繁琐、耗时长、成本昂贵。2.多重连接探针扩增技术(MLPA)，该技 术利用多种引物探针与目的片段杂交，PCR扩增后使用毛细管电泳并相对定量， 此技术相对定量结果准备度高，质控体系完善，但操作复杂，耗时长(3天以 上)，整个流程需要开盖3次，易造成样品的污染，通量较低、成本较高、分 析繁琐。无论是aCGH法还是MLPA法，虽然均可以对UBE3A基因组的拷贝数进行 相对定量，但均存在易污染、费时、费力、成本高的问题，并且拷贝数的相对 定量均为反应终点的半定量，结果判定更依赖经验，而无法形成标准化的判定 方式。

近年来，已有研究人员将Realtime PCR技术应用于基因拷贝数检测。 RealtimePCR即为基于实时荧光定量聚合酶链式反应技术，主要分为SYBR Green和TaqMan两种原理。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连 接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同 时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭 基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧 光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增 一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完 全同步。TaqMan探针使该技术特异性非常高，结果可靠度高，操作简单、使用 方便，样本间污染可能性低，非常适合研究基因寡核苷酸多态性(SNP)和基 因拷贝数变异(CNV)。