[发明专利]ALS相关SOD1基因突变的检测方法及其引物组

说明书

本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，具体公开了一种用于肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关SOD1基因突变的检测方法及其引物组。本发明对ALS相关SOD1基因突变区域序列进行分析，设计相应的引物，对样本基因组DNA特定区域序列经过多重PCR扩增，最后以Ion Torrent半导体芯片测序技术进行检测。本发明的检测方法具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快等优点。为肌萎缩侧索硬化症的遗传学方面的检测、测试、分析和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径，从而为该类疾病的临床诊断提供理论基础。

技术领域

本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，涉及用分子生物学方法对肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关SOD1基因突变进行检测的引物组，特别涉及用Ion Torrent半导体芯片测序技术对ALS相关SOD1基因突变进行定性、定量检测的相关引物组及其试剂盒。

背景技术

肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）也叫运动神经元病（MND），是一种选择性侵犯上、下运动神经元的致死性神经退行性疾病，以皮质、脑干、脊髓运动神经元进行性死亡导致肌无力、肌萎缩和呼吸肌瘫痪为特征。患者出现进行性加重的肌无力和肌肉萎缩，多在起病后3~10年内因呼吸功能衰竭死亡。ALS按其起病方式可分为散发性ALS（Sporadic ALS, SALS）和家族性ALS（Familial amyotrophic lateral sclerosis, FALS），SALS占90%~95%，FALS占5%~10%，两者在临床表现上并无明显区。

ALS多为成人隐袭起病，慢性进行性发展，兼有上下运动神经元受损的症状和体征，表现为肌无力，肌萎缩和锥体束征，一般无感觉障碍以及大小便障碍。

关于ALS的发病机制有较多理论，其中对SOD1基因（铜锌超氧化物岐化酶基因）致病机制研究最多，但具体发病机制尚不清，目前的共识是SOD1基因突变导致蛋白毒性功能获得（Toxic gain of function）而不是功能丧失（Loss of function）。家族性肌萎缩侧索硬化（family amyotrophic lateral sclerosis, FALS）中有15%~20%的家系是SOD1基因突变家系，到目前为止，在FALS患者中已发现SOD1基因有超过150多个突变位点。

SOD1基因定位于21q22.11，基因组DNA全长11kb，含有5个外显子，编码一种153个氨基酸的SOD1蛋白。该蛋白是一种自由基清除酶，在神经组织、肝脏、红细胞中高表达，主要功能是清除细胞内的超氧自由基。约20%的FALS和5%的SALS与该基因突变有关，主要为点突变，其中错义突变占绝大多数。

目前检测ALS相关SOD1基因突变位点的方法有PCR-SSCP、经典测序等，存在通量低、成本贵等问题，对PCR产物长度也有一定限制。

Ion Torrent半导体芯片测序技术是新一代的测序技术，它的核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中的微球上固定DNA链，随后依次掺入单核苷酸dGTP、dCTP、dATP、dTTP。随着每个碱基的掺入，释放出H⁺，H⁺在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H⁺ 的检测，实时判读碱基。由于其化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度，一台仪器即可适合各种测序通量需求的科学研究，在较短的时间内获得真实可靠的实验结果。

Ion Torrent半导体芯片测序技术与传统Sanger法及二代测序技术比较，IonTorrent技术有以下优势：系统无激光光源，无光学系统，无照相系统；使用无标记的核苷酸及酶进行测序，本底干扰低；通过对 H⁺的检测，可以改善碱基判读准确性；测序通量大、速度快，完成1G通量的测序检测仅需2~3小时，是传统Sanger测序方法通量的数千倍以上，同时弥补了已有二代高通量测序方法工作时间过长的缺陷。