[发明专利]一种用于纯化蛋白的表达载体

权利要求书

1.一种表达载体在纯化蛋白中的应用，所述表达载体包括S100蛋白家族基因编码序列以及其他载体元件，所述S100蛋白家族基因编码序列位于能够正常表达的区域，其特征在于，包括如下步骤：

a) 使用所述表达载体构建S100蛋白与待纯化蛋白的重组融合蛋白表达载体;

b) 所述重组融合蛋白的表达:得到表达细胞;

c) 所述重组融合蛋白的分离纯化:收集所述表达细胞，破碎所述表达细胞，离心并收集含所述重组融合蛋白的上清液,所述上清液进行阴离子交换柱初步分离,经过上样、洗脱并收集混合在300至400毫升范围内的洗脱液样品,向所述洗脱液样品中加入氯化钙(CaCl₂),上疏水层析柱，得到所述疏水层析柱纯化后的融合蛋白；

d) 电泳鉴定;

e) 酶切纯化所述疏水层析柱纯化后的融合蛋白，得到待纯化蛋白。

2.根据权利要求1所述的表达载体在纯化蛋白中的应用，其特征在于：所述其他载体元件包括多克隆位点、筛选标记、操纵子、启动子以及终止子，所述多克隆位点区内包括所述S100蛋白家族基因编码序列。

3.根据权利要求1所述的表达载体在纯化蛋白中的应用，其特征在于：所述表达载体是原核表达载体或真核表达载体。

4.根据权利要求1至3任一所述的表达载体在纯化蛋白中的应用，其特征在于：所述S100蛋白家族基因编码序列为S100A蛋白家族基因编码序列、S100B蛋白家族基因编码序列、S100C蛋白家族基因编码序列、S100D蛋白家族基因编码序列、S100E蛋白家族基因编码序列、S100F蛋白家族基因编码序列、S100P蛋白家族基因编码序列、S100G蛋白家族基因编码序列、S100L蛋白家族基因编码序列或S100Z蛋白家族基因编码序列。

5.根据权利要求4所述的表达载体在纯化蛋白中的应用, 其特征在于:所述S100A蛋白家族基因编码序列为S100A1、S100A2、S100A3、S100A4、S100A5、S100A6、S100A7、S100A8、S100A9、S100A10、S100A11、S100A12、S100A13、S100A14、S100A15或S100A16。

6.根据权利要求1至3、5中任一所述的表达载体在纯化蛋白中的应用，其特征在于，满足下列中的一项或几项：

所述步骤a)中选择载体pET32a-S100构建所述待纯化蛋白的重组融合蛋白表达载体，鉴定所述重组融合蛋白的基因序列,获得阳性的重组表达载体；和/或

所述步骤c)中，所述上清液上DEAE-琼脂糖凝胶FF(DEAE-sephrose FF)阴离子交换柱进行初步的分离,所述上样的缓冲液是25 毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH为 7.5，100毫摩尔/升氯化钠(NaCl)，所述洗脱的缓冲液是25 毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH为 7.5，1摩尔/升氯化钠(NaCl)；向所述样品中加入5毫摩尔/升氯化钙(CaCl₂),水系滤器过滤,过滤后的所述样品上疏水层析柱，加入所述上疏水层析柱的平衡缓冲液三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，所述上疏水层析柱的洗脱缓冲液是三羟甲基氨基甲烷-盐酸 (Tris-HCl)和乙二醇双-2-氨基乙基醚-四乙酸(EGTA)。

7.根据权利要求4所述的表达载体在纯化蛋白中的应用，其特征在于，满足下列中的一项或几项：

所述步骤a)中选择载体pET32a-S100构建所述待纯化蛋白的重组融合蛋白表达载体，鉴定所述重组融合蛋白的基因序列,获得阳性的重组表达载体；和/或

所述步骤c)中，所述上清液上DEAE-琼脂糖凝胶FF(DEAE-sephrose FF)阴离子交换柱进行初步的分离,所述上样的缓冲液是25 毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH为 7.5，100毫摩尔/升氯化钠(NaCl)，所述洗脱的缓冲液是25 毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH为 7.5，1摩尔/升氯化钠(NaCl)；向所述样品中加入5毫摩尔/升氯化钙(CaCl₂),水系滤器过滤,过滤后的所述样品上疏水层析柱，加入所述上疏水层析柱的平衡缓冲液三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，所述上疏水层析柱的洗脱缓冲液是三羟甲基氨基甲烷-盐酸 (Tris-HCl)和乙二醇双-2-氨基乙基醚-四乙酸(EGTA)。