[发明专利]一种产生多种单糖产物的内切型双功能褐藻胶裂解酶Aly2及其编码基因与应用

说明书

本发明涉及一种产生多种单糖产物的内切型双功能褐藻胶裂解酶Aly2及其编码基因与应用。Aly2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码Aly2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明制备的基因工程重组蛋白质rAly2对褐藻胶、聚古罗糖醛酸、聚甘露糖醛酸的比活力分别为2025U/mg、3672U/mg和1324U/mg，因此是一种双功能酶。该酶是内切酶，在彻底降解褐藻胶多糖底物时，最终主产物是不饱和二糖和不饱和三糖；在降解不同的寡糖底物时，还能产生饱和型的M、G或不饱和型的Δ等多种单糖产物。此外，rAly2生化性质稳定，因此是一种潜在的工具酶，可应用于医药及食品等领域，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种产生多种单糖产物的内切型双功能褐藻胶裂解酶Aly2及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

褐藻胶是重要的酸性多糖，由β-D-甘露糖醛酸(β-D-Mannuronate,M))和α-L-古罗糖醛酸(α-L-Guluronate,G)以交替排列的顺序通过β-1,4糖苷键连接形成的线性阴离子多糖。在褐藻胶分子内，这两种糖单元通常随机排列组合成聚甘露糖醛酸(Polymannuronate，PM)、聚古罗糖醛酸(Poly guluronate，PG)或甘/古交替嵌段^[1]。天然褐藻胶主要来自巨藻、马尾藻、海带等药食同源的大型海洋褐藻。作为海洋褐藻的结构组分，褐藻胶的含量可达干重的40％以上。此外，一些细菌，如铜绿假单胞菌，棕色固氮菌等能合成并分泌具有乙酰基修饰的褐藻胶^[2]。

褐藻胶因其无毒、无害、吸水成胶的特性被广泛用于食品、化工和医药等行业。近期，越来越多的证据表明褐藻胶寡糖具有重要生物活性，如抗肿瘤、抗凝血、抗细菌，调节细胞凋亡、神经炎症、血糖血脂等。以源自褐藻胶的聚甘露糖醛酸片段制备的一类候选新药“971”能够抑制β样淀粉细胞的聚集，目前已经进入抗阿兹海默症临床研究三期阶段；另有研究表明，聚古罗糖醛酸寡糖与抗生素联合作用可以抑制临床致病菌^[3]。因此制备含有特定M/G比例和特定聚合度大小的不同褐藻胶寡糖具有重要价值。

褐藻胶裂解酶，通过β-消去反应催化褐藻胶分子内糖苷键的断裂，生成聚合度不同的系列寡糖产物，并在新生成的非还原末端糖环内形成C4＝C5不饱和双键，与C5位的C＝O双键形成共轭结构，因而寡糖产物在235nm处具有特征吸收。这种不饱和的糖单元，已经不同于原始的M或G糖单元，故称为Δ单糖^[4]。根据酶的底物选择性，褐藻胶裂解酶可分为G-专一性、 M-专一性和M/G兼性(或称双功能)等三大类。按照底物降解模式的不同，大多数的褐藻胶裂解酶是内切酶，在降解褐藻胶时，最终主产物包括不饱和型二糖、不饱和型三糖，以及更大的系列寡糖产物^[5]；少数一些酶是外切酶，在降解褐藻胶的过程中主产物始终是不饱和型糖单元Δ，该产物利于微生物的生长或者向生物能源如乙醇的深度转化^[4]。与酸降解、碱降解、氧化降解等化学方法，或者超声、微波降解等物理学方法相比，酶解法制备褐藻胶寡糖的反应有条件温和、易控制及产物结构专一等优点，这使得工具型褐藻胶裂解酶的资源发掘与改造逐渐成为海洋生物资源开发的研究重点之一。