[发明专利]一种单细胞全基因组扩增试剂盒

说明书

本发明提供一种更佳的适用于单细胞全基因组扩增的试剂盒，一方面旨在通过优化引物和扩增步骤，可有效应用于固定后的单细胞样本；同时将一种可以特异性切除尿嘧啶核苷酸的酶处理应用于单细胞样品扩增中，可以显著降低扩增的错误率。相对于现有技术，该试剂盒更高效、简单、实用、精准、损失少、成本低、方法重复性好、错误率低、非常适合固定样本的单细胞全基因组扩增试剂盒，拓展了样本应用范围，同时降低了错误率，提高了检测的精密度。

技术领域

本专利属于生物学领域，涉及一种单细胞全基因组扩增试剂盒，尤其涉及一种特别适合固定样本的单细胞全基因组扩增，本专利拓展了样本应用范围，同时降低了错误率，提高了检测的精密度，因此具有广泛的应用前景。

背景技术

高通量测序技术快速发展，目前使用的测序样本大多数还是数百万甚至更多细胞的样本。由于细胞数众多，对其进行研究得到的结果只是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，而单个细胞独有的特性往往会被忽视。特别是在肿瘤研究中，基因突变或者拷贝数变异只存在于极少数细胞(如早期癌细胞)中，多细胞扩增和分析无法检测到这些微小的变异，这就使得单细胞测序尤为重要。

随着技术的发展，单细胞测序越来越受到研究者的青睐，单细胞测序技术正逐渐从实验研究方法成为指导临床的有利工具，为基础研究向临床转化搭建了桥梁。目前单细胞扩增方法主要有简并寡核苷酸引物PCR扩增(Degenerated Oligonucleotide PrimedPCR，DOP-PCR)、多重置换扩增(Multiple Displacement Amplification，MDA)，以及多次退火环状循环扩增(Multipe Annealing and Looping-based Amplification Cycles，MALBAC)等。但是现有技术中，大多数扩增方法只适用于活细胞样本，而对经过甲醛固定的样本扩增效率较差，极大限制了单细胞的应用范围，如何解决固定样本适用已成为现有技术中尚待解决的难题之一。

为了解决这一问题，本专利提供的试剂盒在样本裂解过程中通过调整试剂成分、加入解交联步骤、联合磁珠PCR等方式进行优化，可适用于固定后单细胞样本的扩增，从而使得扩增对象不仅仅只适用于活细胞样本，可适用于固定样本，扩大了使用范围，具有更加广泛的应用前景。

同时碱基错误也是现有技术单细胞扩增过程中面临的主要难题之一。大量研究指出，SNV的假阳性主要是胞嘧啶突变成胸腺嘧啶(C→T)，如果能够减少C→T突变的量，就可以大幅度降低单细胞扩增过程中的碱基错误率，减少SNV的假阳性。现有技术在扩增过程中，为获得高保真、高覆盖度基因组信息难度较大，除了改进扩增方法和分析手段以外，样品的裂解往往会被忽视。在裂解过程中，基因组DNA解螺旋成线状DNA双链，与此同时，部分胞嘧啶会脱氨基成为尿嘧啶。虽然这一过程在细胞内也会偶尔发生，但在体外裂解时，突变的频率则大大提高。这些突变的尿嘧啶如果不经过修复，会在指数扩增中被放大，最终导致SNV假阳性。实际操作中，裂解方法、DNA聚合酶的保真性、扩增区域的GC含量等都会导致碱基错误，从而产生非真实的单核苷酸变异，即SNV假阳性问题。

因此为了解决单细胞扩增中出现的碱基错误率高、扩增偏倚量大、扩增质量不好、假阳性率高等问题，本专利同时创造性地设计并加入酶处理步骤，意想不到的将一种可以特异性切除尿嘧啶核苷酸的酶应用于单细胞样品扩增方法中，可以显著降低扩增的错误率，降低了了非真实的单核苷酸变异产生，同时利用平行样本分析方案，解决可能存在的等位基因缺失问题。

简而言之，本专利提供了一种更好的高效、简单、实用、精准、损失少、成本低、方法重复性好、错误率低、非常适合固定样本的应用的单细胞全基因组扩增试剂盒，拓展了样本应用范围，同时降低了错误率，提高了检测的精密度。

发明内容