[发明专利]针对CD44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系及应用

说明书

基于目前采用壳聚糖(CS)纳米粒的基因靶向输送技术的现状，本发明提供了针对CD44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系及其应用。所述基因靶向输送体系为将双醛基的改性透明质酸HAD共价交联到壳聚糖纳米粒CSNPs上所得到的偶联壳聚糖靶向纳米粒。其中，所述壳聚糖纳米粒CSNPs为包裹siRNA的壳聚糖纳米粒，即CSNps‑siRNA。所述氧化透明质酸HAD中醛基的数目为2个。所述氧化透明质酸HAD采用醇相反应制备得到。本申请采用的醇相反应在室温下室温即可进行，不需要加热；而且透明质酸HA在乙醇溶液中处于溶胀状态，而非溶解态，所以浓度可以在5‑10％(w/v)，一次性反应量大大增加。

技术领域

本发明属于医药领域，涉及基因载体，具体涉及采用改性透明质酸修饰壳聚糖纳米粒得到的靶向基因载体。

背景技术

现代分子生物学研究表明，肿瘤的发生发展是多基因、多阶段、多步骤的复杂演进过程。其根本原因可能在细胞内部基因结构及表达的异常改变，涉及到多种原癌基因、抑癌基因、生长因子及其受体、细胞粘附因子及DNA修复基因等的异常和积累。如Bcl2为一原癌基因，也是最重要的抑制肿瘤细胞凋亡的基因之一。研究表明，Bcl2基因的易位和高表达与肿瘤的发生、发展及不良预后密切相关，降低或消除Bcl2基因在肿瘤细胞中的过度表达，可解除Bcl2对肿瘤细胞凋亡的抑制作用，促进肿瘤细胞死亡和增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。所以，基于分子水平的基因治疗是肿瘤治疗的一项重要策略。而这其中，选择肿瘤细胞特异的分子靶点进行有效治疗，不但可以取得明显疗效，而且避免伤害正常的细胞，因此该方法越来越被医学界所认同。

RNA干扰(RNAi)技术是常用的有效基因技术，许多研究结果证实，运用siRNA分子可以阻断癌症细胞中重要蛋白的表达，阻止恶性表型的出现。因此，RNAi技术作为一种癌症治疗手段，具有巨大的应用潜力。然而，siRNA的治疗效果很大程度决定于其是否能通过机体内的种种屏障，以有效浓度到达靶点组织，所以选择一种既安全又高效的体内递送siRNA的缓释基因载体成为一种迫切的需要。

基于壳聚糖(CS)阳离子多聚物的纳米粒有望成为新一代安全高效的基因载体。由于壳聚糖纳米粒不具有定向的靶向性，对其进行修饰和改造以提高其靶向性成为亟待解决的问题。研究表明，透明质酸(HA)能与细胞表面的CD44受体结合而发挥信号传递与调节细胞生理功能的作用。多种肿瘤细胞表面的CD44受体过度表达，同时相应的正常细胞中表达量并不高。所以，将HA偶联到CS纳米粒上，利用HA与细胞表面CD44具有较强亲和力的特性，可向肿瘤组织输送包裹siRNA的纳米粒，大大提高给药的靶向性。传统方法是通过正负电荷的作用将HA偶联到CS纳米粒上。然而，正负电荷的作用在体内常常由于酸碱度的改变而不稳定，导致偶联上的HA丢失。

发明专利申请201410572404.8公开了“一种改性透明质酸及其制备方法”。该申请通过氧化透明质酸主链糖苷环中的还原性羟基，使糖苷环从相邻的羟基处断链开环，形成具有活性较高的多醛基结构，在不影响材料本身的亲水性以及生物相容性的同时，引入了高活性反应基团。然而，该申请所述的方法存在以下问题：(1)反应温度高，为40-70℃，易导致壳聚糖分子量的降低；(2)透明质酸在水溶液中的质量浓度范围小，仅为1-5％，从而限制了反应的量；(3)反应完毕后需要反复透析洗涤处理才可以得到改性透明质酸，操作复杂；(4)搅拌反应时间长达3-24h，从而导致整个操作过程的时间较长，易导致反应后的醛基活性降低。

此外，还没有氧化透明质酸与壳聚糖纳米粒结合作为CD44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系的相关报道。

发明内容

基于目前采用壳聚糖(CS)纳米粒的基因靶向输送技术的现状，本发明将siRNA包载于CS纳米粒中，并通过氧化改性后的透明质酸(HA)对CS纳米粒进行修饰，从而得到肿瘤靶向纳米粒。本发明还选取CD44高表达膀胱癌及肾癌细胞系，评价该纳米缓释基因载体在肿瘤靶向治疗中的作用，探讨其作为基因靶向输送载体的可行性，为临床开发应用和探索CD44高表达型肿瘤基因治疗的新途径提供依据。