[发明专利]一种两离子淀粉基干细胞扩增水凝胶的制备方法及干细胞扩增和收集方法

说明书

本发明一种两离子淀粉基干细胞扩增水凝胶的制备方法及干细胞扩增和收集方法；水凝胶由甲基丙烯酸酯改性两离子淀粉和双端巯基改性聚乙二醇通过巯基‑烯点击手段形成，并在制备过程中引入CGRGDS多肽，提高水凝胶对细胞的亲和能力。该水凝胶可通过聚合物的含量使其力学强度控制在27.21‑69.92kPa.更为重要的是，其能够有效降低细胞扩增过程中非特异性蛋白的粘附。具有良好的生物相容性，能够支持棕色脂肪干细胞的增殖，并在增殖过程中保持其干细胞特性。可为组织工程和细胞治疗策略提供坚实的技术支持。本发明通过“点击”化学获得，免除有机溶剂的参与，环境友好，减少了由于合成过程而造成的支架生物相容性降低的缺点。

技术领域

本发明涉及一种干细胞扩增水凝胶及其制备方法基于两离子淀粉水凝胶的干细胞扩增和收集方法，属于生物医学工程领域。

背景技术

干细胞是人体及其各种组织细胞的最初来源，具有高度自我更新能力、高度增殖和多向分化潜能、可植入性和重建能力等特征。在细胞治疗和组织工程中具有良好的应用前景，其规模化扩增是其临床应用的前提和基础。在临床治疗及组织工程应用时需求量较大，一般在10⁹-10¹¹之间，传统的二维培养技术由于扩增效率低无法实现干细胞的规模化扩增，近年来，发展的基于微载体的3D培养技术在一定程度上了实现细胞的规模化扩增。但是，也存在一些问题需要解决，例如，在培养过程中容易受到非特异性蛋白的干扰，使细胞在扩增过程中“干性”维持困难，特别是对于一些具有自分化能力的细胞(例如：具有心肌自分化能力的棕色脂肪干细胞)，这种现象更为明显。为此，开发一种具有抗蛋白非特异性粘附的干细胞扩增水凝胶具有十分重要的意义。

两性离子聚合物可通过优良的亲水性能，在其表面形成水合层，阻止蛋白的粘附，具有良好的抗蛋白粘附性能。同时具有良好的生物相容性，能够支持多种细胞的增殖，在干细胞扩增中具有潜在的应用前景。为了改善现有细胞扩增用载体的缺点，我们以两性离子淀粉为基材，采用“点击”化学的手段创造性地研制了一种干细胞扩增用水凝胶，两性离子基团的引入可为“干性”维持创造有利的条件。

发明内容

本发明的目的在于克服现有干细胞扩增技术的不足，提供一种生物相容性好、抗蛋白非特异性粘附的两离子淀粉基水凝胶为干细胞扩增载体。

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备上述两离子淀粉基干细胞扩增水凝胶的制备方法。

本发明的上述目的通过下述技术方案予以实现。

一种两离子淀粉基干细胞扩增水凝胶的制备方法；包括如下步骤：

(1)将淀粉置于去离子水中，形成淀粉悬浮液；将等体积的NaOH溶液滴加到淀粉悬浮液中，将混合物升温至30-40℃反应，得到碱化淀粉溶液；

(2)将二甲基(氯丙基)铵丙磺酸盐溶于去离子水中，滴加到步骤(1)的碱化淀粉溶液中，并加热至50-80℃，4-7小时后，冷却至室温，用冰乙酸中和至中性；然后向体系中加入与反应体系等体积的去离子水；并将此溶液滴加到甲醇中进行沉析，而后离心，并用甲醇洗；室温真空干燥后，得到两离子淀粉；

(3)将步骤(2)获得的两离子淀粉溶于二甲基亚砜中，同时将氯化钠加入其中，在130℃下充分溶解，并持续搅拌直至溶液冷却至50℃；在氮气保护下加入4-二甲氨基吡啶，继续搅拌30-60分钟后，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应12-36小时；将反应混合液倒入甲醇中析出棕褐色粉末状固体，抽滤，再将粗产物用甲醇洗涤后真空干燥，得到纯净的甲基丙烯酸酯改性的两离子淀粉；

(4)将甲基丙烯酸酯改性两性离子淀粉溶液于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，并在其中加入半胱氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸多肽(CGRGDS)，反应10-30分钟；

(5)再将双端巯基改性聚乙二醇溶解于PBS中，形成浓度为0.1-40％的溶液；