[发明专利]一种两离子淀粉基干细胞扩增水凝胶的制备方法及干细胞扩增和收集方法

权利要求书

1.一种两离子淀粉基干细胞扩增水凝胶的制备方法；其特征是步骤如下：

(1)将淀粉置于去离子水中，形成淀粉悬浮液；将等体积的氢氧化钠溶液滴加到淀粉悬浮液中，将混合物升温至30-40℃反应，得到碱化淀粉溶液；

(2)将二甲基(氯丙基)铵丙磺酸盐溶于去离子水中，滴加到步骤(1)的碱化淀粉溶液中，并加热至50-80℃，4-7小时后，冷却至室温，用冰乙酸中和至中性；然后向体系中加入与反应体系等体积的去离子水；并将此溶液滴加到甲醇中进行沉析，而后离心，并用甲醇洗；室温真空干燥后，得到两离子淀粉；

(3)将步骤(2)获得的两离子淀粉溶于二甲基亚砜中，同时将氯化钠加入其中，在130℃下充分溶解，并持续搅拌直至溶液冷却至50℃；在氮气保护下加入4-二甲氨基吡啶，继续搅拌30-60分钟后，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应12-36小时；将反应混合液倒入甲醇中析出棕褐色粉末状固体，抽滤，再将粗产物用甲醇洗涤后真空干燥，得到纯净的甲基丙烯酸酯改性的两离子淀粉；

(4)将甲基丙烯酸酯改性两性离子淀粉溶解于磷酸盐缓冲溶液中，并在其中加入半胱氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸多肽，反应10-30分钟；

(5)再将双端巯基改性聚乙二醇溶解于磷酸盐缓冲溶液中，形成浓度为0.1-40％的溶液；

(6)将等体积的步骤(4)和步骤(5)制备的溶液混合，置于37℃下凝胶化，最终得到两性离子淀粉/聚乙二醇/精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽两离子淀粉基干细胞扩增水凝胶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(1)中淀粉悬浮液质量浓度为20-60％；氢氧化钠溶液浓度为25w/v％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(1)中在30-40℃反应0.5-3h。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(2)中淀粉的质量是二甲基(氯丙基)铵丙磺酸盐质量的0.3-30倍。

5.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(2)中二甲基(氯丙基)铵丙磺酸盐溶于去离子水溶液质量浓度是1-10％。

6.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(2)甲醇体积为去离子水体积的1-5倍。

7.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(3)两离子淀粉溶于二甲基亚砜的质量浓度为2-7％；氯化钠的浓度为2-8％；4-二甲氨基吡啶浓度为0.5-3％；甲基丙烯酸缩水甘油酯浓度为1-5％。

8.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(4)甲基丙烯酸酯改性两性离子淀粉溶液于磷酸盐缓冲溶液中质量浓度1-30％；并在其中加入半胱氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸多肽，质量浓度控制0.01-0.1％。

9.以非治疗目的的基于权利要求1制备两离子淀粉基干细胞扩增水凝胶的干细胞扩增和收集方法，其特征主要包括以下过程：

(1)将干细胞重悬于权利要求1步骤(6)所述的混合溶液中，并加入5-15％的胎牛血清，然后制备水凝胶/干细胞复合体；

(2)将步骤(1)制备的水凝胶/干细胞复合体浸泡于细胞培养液中，37℃和5％CO₂条件下常规培养，每天换液；

(3)培养7-14天后，采用氢氧化钠溶液将培养液pH调控至7.8-8.5，5-30分钟后，水凝胶全部降解后，采用大量的培养液快速稀释，使其pH调整为中性，离心收集扩增的细胞；

所述干细胞为棕色脂肪干细胞、白色脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞的一种。