[发明专利]一种荧光定量PCR技术检测意大利蜜蜂王浆主蛋白MRJP 2基因表达的方法

说明书

本发明公开了一种荧光定量PCR技术检测意大利蜜蜂王浆主蛋白MRJP2基因表达的方法，具体涉及生物技术领域，本发明中意大利蜜蜂MRJP 2实时荧光RT‑PCR检测方法的建立，包括以下步骤：(1)使用引物进行基因的检测和获得；(2)总RNA的提取；(3)cDNA合成；(4)实时荧光PCR；(5)苯菌灵处理前后意大利蜜蜂MRJP 2的相对表达量计算；本发明采用的实时荧光RT‑PCR与常规PCR相比，实时荧光PCR技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，进一步提高灵敏度；且RT‑PCR无须PCR后处理，避免污染，保证结果的可靠性和重复性，实时荧光RT‑PCR技术也免除常规PCR中电泳、定量扫描等后续繁琐步骤，大大缩短了实验时间。

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及涉及用于检测意大利蜜蜂MRJP 2基因表达的特异性引物，一种荧光定量PCR技术检测意大利蜜蜂王浆主蛋白MRJP 2基因表达的方法。

背景技术：

蜂王浆是由蜂群中青年工蜂头部的咽下腺和上颚腺分泌而来，呈现为一种黏稠的乳浆状物质，蜂王浆富含多种对机体有益的物质，其中蛋白质约占干质量的50％，包括水溶性蛋白质和水不溶性蛋白质。水溶性蛋白质占蜂王浆中总蛋白质含量的46％～89％，为蜂王浆蛋白质的主要部分，称为蜂王浆主蛋白(major royal jelly proteins，MRJPs)。

王浆主蛋白成分为一个蛋白质家族，迄今为止，研究人员已经发现10个成员(MRJP1～MRJP 9和MRJPψ)，分子量在49-87kDa，其中5种蛋白质，即MRJP 1–MRJP 5，占蜂王浆总蛋白的82％-90％。

MRJPs作为蜂王浆中的主要活性成分，不仅具有促进细胞增殖、抑菌、抗氧化、抗疲劳等功效，还具有多种生物学功能，如参与决定蜂群中雌性蜂的级型分化，为幼虫的发育提供必要的可利用氮元素，以及可能在蜜蜂行为调控中起作用等。但是MRJPs中各个成员之间的功能不同，所以针对MRJPs中单一组分的研究很有必要。

MRJPs家族中，MRJP1和MRJP2是被研究比较全面的成员，二者含量约占蜂王浆总蛋白的47％。MRJP2是蛋白质家族的第2个成员，其在蜂王浆主蛋白中含量中等，为16％左右。MRJP2的分子量为49-52.7kDa，等电点为6.2～7.9，属于一种弱碱性糖蛋白。Simúth等研究发现MRJP2可以刺激小鼠巨噬细胞释放肿瘤坏死因子(TNF-α)，提出其抗癌应用的潜在生理价值。Bíliková等研究发现MRJP2能够抑制芽孢杆菌属(Paenibacialus larvea)的生长，提示蜂王浆中功能蛋白组分MRJP2在药物研究方面的应用前景。

我国是养蜂大国，蜂群数量和蜂产品产量、出口量均居世界第一，目前，中国蜂蜜年产量40多万吨，占世界蜂蜜总产量1/4以上。近年来其质量安全问题多次曝光，已经受到政府部门和社会各界的高度重视和普遍关注。蜂产品质量安全隐患主要包括抗生素残留、重金属污染以及滥用添加剂等方面。其中，蜂产品中抗生素残留问题较为严重。蜂产品抗生素残留主要是蜂病防治过程中用药不科学造成的，在意大利蜜蜂养殖过程中，蜜蜂常受白垩病的困扰，蜜蜂白垩病是由于蜂球菌危害引起的，给养蜂业造成很大威胁。蜂农常用苯菌灵药物来防治蜜蜂白垩病。

苯菌灵别名为1-正丁胺基甲酰-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯，是一种高效、低毒的广谱杀菌物质，多应用于农业生产中病虫害的防治工作，在使用和分析处理过程中，容易转化为多菌灵，多菌灵属于新型苯胺类苯并咪衍生物，化学性质稳定，降解半衰期较长，能持久地残留在使用部位，易致累积效应对生态环境和人类健康造成威胁，若使用不当，可对生育能力、危害胎儿、损害遗传基因，三项人体健康造成影响。

苯菌灵是防治蜂群白垩病的常用药物，施药期间对于蜂群所产蜂王浆的品质是否有影响，是关系蜂产品安全生产的大问题。通过观测蜜蜂体内MRJPs的表达水平，可以从一定的程度上反应蜂群所产蜂王浆的质量。本专利检测的MRJP2在蜂王浆MRJPs占有较大的比例，荧光定量PCR检测饲喂苯菌灵前后蜂群体内MRJP2的相对表达水平，对于苯菌灵的药物使用量，蜂产品的安全生产都具有重要的意义。