[发明专利]一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用

说明书

本发明公开了一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用。本发明的方法包括如下步骤：(1)将发酵液先经大孔树脂富集，再依次经过缓冲液和水进行洗脱，收集洗脱液，得到富含吡咯喹啉醌的富集液；(2)将所述富含吡咯喹啉醌的富集液经亲水性硅胶填料纯化，得到吡咯喹啉醌母液；(3)使所述吡咯喹啉醌母液中的吡咯喹啉醌结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；(4)采用碱溶酸沉法将所述吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。通过实验证明：本发明的方法具有工艺操作简单、衔接度高，产品回收率和纯度高的特点，可用于大规模工业化生产制备吡咯喹啉醌。

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用。

背景技术

吡咯喹啉醌(PQQ)属于芳香三环邻位醌，作为核黄素和吡啶核苷酸之后发现的第三种氧化还原酶辅因子。PQQ参与脱氢酶的氧化还原过程，协同COQ完成呼吸链的电子传递，广泛存在于生物体内，具有促进神经生长因子合成与修复、防止神经细胞纤维化、清除自由基以及维护线粒体能量代谢功能等生理功能，在医药、食品和化妆品领域具有广阔的应用前景。化学合成法由于异构体和副产物多、产率低、合成步骤繁琐且需使用多种有毒试剂等问题逐渐被微生物发酵法所替代。

甲基营养菌的PQQ合成量高，生丝微菌Hyphomicrobium sp.TK 0441的产量为1g/L(Applied and Environmental Microbiology，1992；58(12)：3970-3976)；甲基营养菌Methylovorus sp.MP688的产量高达2g/L(CN 103224965)，并且培养基组分只需含有甲醇和无机盐，成本低廉、下游纯化工艺较为简单是微生物发酵法合成PQQ产业化的主要生产菌株。因此，开发分离步骤少、衔接度好且回收率高的分离纯化工艺从甲基营养菌发酵液中提取PQQ是产业化的关键步骤。目前，关于发酵液中PQQ的提取方法有络合萃取分离纯化法(CN104892597)、离子对双水相萃取分离结合阴离子交换树脂吸附纯化法(CN 105294687)、DEAE-葡聚糖凝胶吸附分离结合C18固相萃取纯化法(CN 1138776和US 4994382)以及HP-20大孔树脂吸附分离结合聚酰胺柱纯化法(CN 104328155)。上述方法需要使用大量的正己烷、甲醇或乙醇等有机溶剂，工业化应用成本高且污染环境。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种从发酵液中分离纯化吡咯喹啉醌的方法。

本发明提供的从发酵液中分离纯化吡咯喹啉醌的方法包括如下步骤：

(1)将发酵液先经大孔树脂富集，再依次经过缓冲液和水进行洗脱，收集洗脱液，得到富含吡咯喹啉醌的富集液；

(2)将所述富含吡咯喹啉醌的富集液经亲水性硅胶填料纯化，得到吡咯喹啉醌母液；

(3)使所述吡咯喹啉醌母液中的吡咯喹啉醌结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；

(4)采用碱溶酸沉法将所述吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。

上述方法中，所述大孔树脂为非极性大孔树脂。所述非极性大孔树脂的比表面积为800-1000m²/g，平均孔径为15-20nm，优选为美国罗门哈斯公司生产的XAD 18、XAD 1600N和XAD 16N大孔吸附树脂。

上述方法中，所述亲水性硅胶填料为亲水性C₁₈硅胶填料，优选为华谱新创科技有限公司生产的C18HC填料。

上述方法中，所述步骤(1)前还包括如下步骤：将发酵液离心(10000×g离心5min)，收集上清液；将所述上清液过滤(1KDa的中空纤维膜)，收集滤液。