[发明专利]一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用

权利要求书

1.一种从发酵液中分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括如下步骤：

（1）将发酵液先经大孔树脂富集，再依次经过缓冲液和水进行洗脱，收集洗脱液，得到富含吡咯喹啉醌的富集液；所述洗脱的具体步骤如下：先用pH 6.5的0.1 M磷酸盐缓冲液以2 BV/h的流速洗脱1 BV，再用纯水以2 BV/h的流速继续洗脱，洗脱液颜色先由无色变为红色至暗红色，最后变为黄色，收集红色至暗红色的洗脱液，即为富含吡咯喹啉醌的富集液；

（2）将所述富含吡咯喹啉醌的富集液经亲水性硅胶填料纯化，得到吡咯喹啉醌母液；

（3）使所述吡咯喹啉醌母液中的吡咯喹啉醌结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；

（4）采用碱溶酸沉法将所述吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌，具体为：用水溶解所述吡咯喹啉醌粗晶体，得到浓度为10-15 g/L的粗晶体溶液；用氢氧化钠水溶液调节所述粗晶体溶液的pH至10.0-10.5，再用硫酸溶液调节pH至2.0-3.5，静置，离心，收集沉淀即得到吡咯喹啉醌；

所述步骤（1）前还包括如下步骤：将发酵液离心，收集上清液；将所述上清液过滤，收集滤液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述大孔树脂为非极性大孔树脂。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述亲水性硅胶填料为亲水性C₁₈硅胶填料。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述步骤（3）的方法为用水将所述吡咯喹啉醌母液稀释至浓度为4-5 g/L，用磷酸或盐酸调节pH至3.0-3.5，析出红褐色固体，静置，离心，收集沉淀即得到吡咯喹啉醌粗晶体。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述发酵液为甲基营养菌发酵液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述甲基营养菌为脱氮生丝微菌Hyphomicrobium denitrificans或扭托甲基杆菌Methylobacterium extorquens；

或，所述脱氮生丝微菌Hyphomicrobium denitrificans具体为脱氮生丝微菌Hyphomicrobium denitrificans CGMCC 10620或脱氮生丝微菌Hyphomicrobium denitrificans DSM 1869；

或，所述扭托甲基杆菌Methylobacterium extorquens具体为扭托甲基杆菌Methylobacterium extorquens CGMCC 1.6987。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述静置的条件为4℃-10℃静置12h。

8.权利要求1-7中任一所述的方法在制备吡咯喹啉醌中的应用。

9.权利要求1-7中任一所述的方法在提高吡咯喹啉醌晶体纯度中的应用。