[发明专利]一种生物酶法丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物酶法丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料制备方法，其特征是借助于漆酶催化氧化丝素蛋白中丝氨酸和酪氨酸残基，并与含氨基的羧甲基壳寡糖反应，结合仿生矿化，制备丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料，属于纺织生物技术领域。

背景技术

丝素来源于脱胶后的桑蚕丝，其光泽优雅，机械性能与吸湿性优良，是较为理想的纺织纤维原料。与此同时，丝素蛋白本身还具有良好的生物相容性和环境友好性，以丝素为原料加工的再生材料具有无毒、无刺激性、低免疫原性等优点，是一种性能优良的天然生物制品与医用生物材料。

丝素基生物材料的性能与其分子量、蛋白二级结构有较大的相关性。丝素纤维经钙盐或锂盐溶解后，丝素蛋白大分子发生溶解和部分水解，通过透析去除盐离子，可得到丝素蛋白溶液。在此过程中，丝素的溶解条件影响体系中蛋白分子量大小、二级结构和极性基团(如羧基、氨基等)数量，即分子量较小的丝素蛋白体系中羧基和氨基数较多；分子量较大的丝素蛋白中羧基和氨基数较少。分子量较大的丝素蛋白有利于再生丝素蛋白材料的制备，能显著增加材料的力学性能，但由于负电性羧基含量较少，在仿生矿化中丝素对钙离子络合能力下降，影响丝素表面磷酸钙盐沉积与矿化效果。与之相比，分子量较小的丝素分子中羧基含量多，对钙离子络合能力较强，利于通过仿生矿化制备丝素/磷酸钙盐复合材料，其缺点是低分子量丝素影响丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料的力学性能。因此，在制备丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料的过程中，如何在获得较好仿生矿化效果的同时，提升复合材料的力学性能，是亟待解决的问题。

目前，丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料制备中，多采用化学交联法提升丝素分子量，再结合SBF模拟体液或钙离子-磷酸盐矿化液进行仿生矿化处理。化学交联法多借助戊二醛、碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等，使丝素大分子间共价交联，此类方法在增加材料力学性能的同时，也存在一定的不足，如交联反应中易产生化学有害物质残留、或交联后丝素中羧基数量减少，仿生矿化性能下降等问题。近年来，随着生物技术应用研究的发展，借助酶法进行丝素基再生材料制备日趋成为热点。酶法较传统化学方法具有高效、专一、作用条件温、环境友好的优点，日益成为材料学科领域研究的热点。漆酶(Laccase)是一种具有催化氧化活性的氧化酶，不仅能催化氧化L-酪氨酸的酚羟基，形成反应性较强的醌类活性基；而且对L-丝氨酸的醇羟基也有一定氧化功效，能产生反应性醛基。上述醌类活性基、醛基均能与含有氨基的化合物发生席夫碱反应，形成分子间交联，这为基于酶法的丝素蛋白接枝改性和仿生矿化提供了新方法。

本发明中通过漆酶催化氧化丝素，产生反应性较强的醌类活性基和醛基，并与羧甲基壳寡糖分子链中的氨基反应形成共价键。通过此方法，不仅形成了以羧甲基壳寡糖为连接方式的丝素分子间交联，增加了丝素分子量和力学性能，而且通过引入较多负电性羧基，提升了丝素诱导矿化性能，有利于丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料的制备，可应用于医用仿生骨基质支架材料的构建。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种生物酶法丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料制备方法，使用本发明可在温和条件下提高催化丝素蛋白分子间交联，同时改善丝素的仿生矿化效果，提高丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料的性能。

本发明的技术方案：一种生物酶法丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料制备方法，其特征是借助漆酶催化氧化丝素蛋白中丝氨酸和酪氨酸残基，将羧甲基壳寡糖接枝到丝素分子上，改善丝素的仿生矿化性能，制备丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料，具体工艺与步骤如下：

(1)丝素蛋白溶液制备：以溴化锂或氯化钙溶解脱胶后的桑蚕丝，制备丝素溶液；

处理工艺处方及条件：将脱胶后的桑蚕丝加入到溴化锂或氯化钙的水溶液中，在60～80℃溶解后，以去离子水中透析8～36小时后过滤，制得浓度为10～50g/L丝素溶液；

(2)漆酶催化丝素接枝羧甲基壳寡糖：在步骤(1)处理后的丝素蛋白溶液中加入漆酶和羧甲基壳寡糖处理；

处理工艺处方及条件：漆酶1～10U/mL，羧甲基壳寡糖0.5～5g/L，处理温度20～60℃，pH范围4.0～7.0，处理时间2～24小时；然后以去离子水中透析8～36小时，去除未反应的羧甲基壳寡糖，制得浓度为20～50g/L的改性丝素溶液；

(3)改性丝素蛋白膜成型：将步骤(2)反应后的丝素溶液在-50～-20℃条件下冷冻干燥，制成丝素蛋白膜；然后将该丝素蛋白膜在50～80％乙醇溶液中浸渍0.25～1小时，在30℃烘干；