[发明专利]一种肺及肺癌组织培养方法以及用其构建肺癌小鼠动物模型方法

说明书

本发明公开了一种体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，包括获取新鲜的人源肺组织细胞，胶原酶消化为单细胞；体外3D培养条件培养人肺组织及肺癌组织类器官。体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官（organoid）的方法：获取新鲜的人源肺组织细胞，胶原酶消化为单细胞；体外3D培养条件培养人肺癌组织类器官；HE染色明确结构及形态，q‑PCR检测相关基因表达；免疫荧光染色鉴定细胞来源检测相关蛋白表达。以及基于上述的类器官构建小鼠动物模型的方法，对于构建大规模一致性好的人源、原位肺癌动物模型具有重要的意义，为肺癌的基础研究工作提供较好的基础及相关临床应用前景。

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别是人肺正常组织及肺癌组织类器官培养体系，属于细胞培养或组织培养技术。本发明还包括了利用培养得到的肺癌组织构建小鼠动物模型的方法。

背景技术

肺癌是目前发病率及死亡率第一的恶性肿瘤，肺组织/肺癌组织细胞原代培养及肺癌动物模型是研究肺癌发生、发展及治疗等的重要工具。

传统的二维细胞培养技术使得培养的细胞在体外环境下逐渐失去其在体内原有状态，其形态、生物功能、遗传等方面的表现和人体内细胞差异极大，不能够满足现有的对于人肺癌医学研究需要。

体外3D培养条件下使用成熟人体细胞培养人体组织类器官(organoid)，这种类器官可在体外表现出与体内细胞相似的遗传物质以及结构的稳定性，并可以在体内和体外被顺利诱导为具有正常功能的组织细胞。科学家已成功在体外3D培养条件下使用成熟人源组织细胞培养出肝脏、小肠等组织类器官。这些类器官细胞在体外培养条件下保持与体内细胞相似的遗传物质，并且具有形态结构的稳定性，可以在体内外被顺利诱导为具有正常功能的对应组织细胞。这一技术可以为研究提供充足的遗传稳定、均一的体外培养的组织细胞，并将可能对直接研究基因在人体细胞中的作用提供巨大的帮助。

目前还未有关于肺组织及肺癌组织类器官培养的方法，成功在体外构建肺组织及肺癌组织类官培养体系，可以为我们提供充足的遗传稳定、均一的体外培养人源肺正常细胞或肺癌细胞，将对肺及肺癌研究提供巨大的帮助。

另外，当前常用于科学研究的肺癌动物模型主要分为三类，包括基因工程小鼠模型、移植瘤模型以及人源异种移植瘤模型(PDX，patient derivedXenograftmodel)，如表1所示。

表1肺癌动物模型

由于小鼠肿瘤基因组研究结果距离直接用于指导人类肿瘤基因组学研究还有较大距离；而细胞系移植瘤模型则局限于细胞系与人源肿瘤细胞从基因及生物学功能等方面差异；PDX模型虽然部分弥补了上述两种模型的缺陷，且也是当前较为流行的研究人源肿瘤生物学特征或药物筛选及鉴定的主要方法，但仍存在局限，由于皮下移植的原因，传统PDX模型无法提供肺组织原位微环境，进而可能导致人源肿瘤在实验过程中相关生物学特征丢失，无法模拟人体内的情况；另一方面，构建PDX模型对人源肺癌细胞数量有一定的要求(每只小鼠需要5*10^5个细胞对应组织块)，而目前临床肿瘤标本非常珍贵，一些特殊的临床标本如穿刺标本等小标本可供实验研究的组织细胞量较少，可能无法满足模型构建需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中缺少遗传稳定、均一的体外肺组织/肺癌细胞培养方法，所存在的对于肺癌发病机理、肺癌治疗药物研究限制的问题，提供一种人肺正常组织和/或肺癌组织培养方法。成功采用3D培养技术在体外构建肺组织及肺癌组织类官培养体系，为实验研究提供充足的遗传稳定、均一的，与人体细胞高度一致的体外培养细胞，将对肺及肺癌研究提供巨大的帮助。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，包括获取新鲜的人源肺组织细胞，胶原酶消化为单细胞；体外3D培养条件培养人肺癌组织类器官。