[发明专利]鉴定或辅助鉴定食源性致病菌的GeXP多重PCR方法的成套试剂与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，鉴定或辅助鉴定食源性致病菌的GeXP多重PCR方法的成套试剂与应用。

背景技术

近年来食源性疾病已成为当今许多国家面临的公共卫生问题，食源性致病菌包括大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌、单核细胞增生性李斯特菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌等。这些严重危害人类健康和食品安全的重要因素的致病菌是引起肠道细菌性感染和细菌性食物中毒的重要病原体。大肠杆菌O157：H7作为一种重要的食源性致病菌在我国畜禽等与人接触密切的动物粪便中的检出率非常高，感染后可并发溶血性尿毒症；沙门氏菌是目前世界公认引起食源性疾病的重要致病菌,主要通过食物和饮水传播,肉及肉制品的污染率最高，感染后可引起胃肠炎、败血症；霍乱弧菌所致的霍乱为烈性肠道传染病，具有发病急、传播快、流行范围广等特征，曾在世界上发生过几次大流行，至今仍未平息，是我国传染病法规定的甲类传染病，也是当前三种国际检疫传染病之一；单核细胞增生性李斯特菌主要污染肉类、乳制品和蔬菜等,这就使得食品在储运、加工过程中容易被单核细胞增生性李斯特菌污染，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多；空肠弯曲杆菌是二十世纪80年代起受到国内外广泛重视的人畜共患病原菌,该菌广泛存在于家禽类动物的肠道中,污染水源或食物后可引起腹泻的爆发；副溶血弧菌能够引起多种无脊椎动物致病，特别水产品，致病菌株可引起人类腹泻、恶心、呕吐、腹部痉挛，严重的可以引起昏迷、脱水甚至死亡；金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，因此，食品受其污染的机会很多，金黄色葡萄球菌除了引起感染外，其产生的肠毒素可污染食物而致食物中毒引起呕吐腹泻，为人类带来非常严重的公共卫生负担。这些菌不仅给养殖业带来巨大的经济损失，还严重威胁人类健康，建立快速、准确的检测方法意义重大。

检测7种致病菌的常规方法需要分离培养、生化试验和血清学鉴定等多个步骤，操作也十分繁琐、费时，对多重混合感染的鉴别诊断就更为困难。近年来，随着分子生物学的发展，PCR技术已被广泛应用于这些食源性致病菌的检测，并建立了多重PCR检测技术，同时检测几种病原，但需几对引物组合在一起同时竞争地扩增，引物之间会产生相互干扰，多增加一对引物，敏感性就越低。PCR产物需通过琼脂糖电泳才可观察结果，该电泳难以区分50bp-100bp以内的条带，一般只可做到2-4重PCR，难以达到高通量的检测。多重荧光PCR一般只检测到3重，由于探针要标记不同发光波长的荧光基团，如标记太多的荧光基团，相互会产生干扰，因此，也只能检测到2-4重。由于在多重PCR反应体系中同时存在几对引物，使得形成复杂引物二聚体的概率大大增加，同时检测的目的基因数量有限(多在2-4个基因)，使得多重PCR还达不到高通量快速检测和分析的目的。目前急需一种同时可检测多种食源性细菌的试剂或试剂盒。

GeXP系统(Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)是美国Beckman Coulter公司研发的用于研究多基因表达定量分析的平台。GeXP多重PCR扩增采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物(即基因特异性引物5’端连接通用引物序列)相结合引发多重体系扩增。PCR反应之初，先由反向特异性嵌合引物与原始模板结合进行逆转录反应，再由正向特异性嵌合引物合成cDNA的第二链，此后，由正、反向嵌合引物的特异性序列以cDNA为模板启动PCR反应，分别扩增出通用引物的互补序列；再由反应体系中占主导地位的荧光标记通用引物，与其互补序列结合，引发后续扩增,通用引物与反应体系中带有荧光标记的碱基序列互补，PCR产物经GeXP毛细管电泳分离，含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测，依据检测片段与标准分子片段(DNA Size Standard,DSS)迁移时间计算出扩增片段的长度，荧光信号强度代表该分离片段的扩增含量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何同时检测大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、霍乱弧菌、单核细胞增生性李斯特菌、空肠弯曲杆菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定食源性致病菌的成套试剂，所述成套试剂由名称分别为引物对A、引物对B、引物对C、引物对D、引物对E、引物对F和引物对G的引物组成；

所述引物对A由名称分别为A-F和A-R的单链DNA组成；

所述A-F是如下a1)至a4)中的任一种单链DNA：

a1)序列表中序列1的第19-43位所示的单链DNA；