[发明专利]一种杆状病毒基因组的合成方法及其在重组杆状病毒构建中的应用

说明书

本发明提供了一种杆状病毒基因组的合成方法及其在重组杆状病毒构建中的应用，属于生物技术领域。本发明提供的一种杆状病毒基因组的合成方法，包括使用引物组合和穿梭载体。引物组合包括杆状病毒全基因组扩增引物组合和线性载体扩增引物组合，应用该引物组合合成的基因片段，可在酵母中通过多片段的拼接合成出杆状病毒基因组，方便对杆状病毒基因组的任意位点进行改造；该方法中用于完整基因组拼接的穿梭载体带有能在昆虫细胞方便检测的基因，所合成的杆状病毒基因组可通过转染昆虫细胞获得有感染活性的病毒，方便用于拯救基因组改造后的杆状病毒；应用上述方法构建重组杆状病毒，方便快速高效，利于推广应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种杆状病毒基因组的合成方法及其在重组杆状病毒构建中的应用。

背景技术

杆状病毒是一类广泛存在于自然界的昆虫病毒，其感染能够导致昆虫的液化死亡。杆状病毒的基因组由一条双链环状DNA组成，基因组大小在80-180kb之间。杆状病毒的生活周期中产生两种不同形态的病毒粒子：出芽型病毒粒子(budded virus，BV)和包埋型病毒粒子(occlusion-derived virus，ODV)。两种病毒粒子分别介导了杆状病毒生活周期中的口服感染和系统感染两个阶段。

随着研究的深入，杆状病毒已在生物防治、真核基因表达、表面展示以及基因治疗等方面得到越来越广泛的应用。重组杆状病毒，可通过改良病毒基因组，提高杆状病毒的性能，进一步促进杆状病毒的应用。例如在真核基因表达、表面展示以及基因治疗等方面的应用中，一般只应用杆状病毒的出芽型病毒粒子BV，故去除与BV不相关的基因可以简化病毒基因组，扩大外源基因的容量。另外，杆状病毒作为生物杀虫剂在农业领域受到宿主谱狭窄的限制，开发宿主域广谱的杆状病毒作为高效的生物杀虫剂具有重要的农业应用价值。在这个过程中都需要对杆状病毒基因组进行遗传改造，从而构建出性能良好的重组杆状病毒。

目前，比较常用的杆状病毒基因组改造技术是同源重组技术。同源重组技术每次只能缺失(替换)一个或者多个串联在一起的基因。这使得同源重组技术在大规模不同位点的遗传改造方面的应用受到了阻碍。

合成生物学技术是近些年发展起来的人工合成大分子DNA的技术，在合成的过程中可以定向改造DNA，且可以进行多个位点的改造。合成生物学已经被用于一些RNA病毒和小DNA病毒的构建，但对于基因组大于40kb的病毒，由于基因组的复杂性以及病毒拯救的难点，尚无技术上的突破。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种杆状病毒基因组的合成方法；以解决杆状病毒人工合成的技术难点。

本发明的第二目的在于提供上述合成方法在合成杆状病毒基因组中的应用。

本发明的第三目的在于提供上述合成方法所得到的杆状病毒基因组在构建重组杆状病毒中的应用。

为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：

一种杆状病毒基因组的合成方法，该合成方法包括使用引物组合和穿梭载体，引物组合包括杆状病毒全基因组扩增引物组合和线性载体扩增引物组合，杆状病毒全基因组扩增引物组合包括第1-45引物对，第1-45引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-90所示；线性载体扩增引物组合包括第46-54引物对，第46-54引物对的碱基序列分别如SEQ IDNo.91-108所示；穿梭载体的碱基序列如SEQ ID No.109所示。

上述的合成方法在合成杆状病毒基因组中的应用，包括：以杆状病毒基因组为模板，用第1-45引物对分别进行PCR扩增反应，得到第1-45目的基因组片段；

以线性化的第一载体为模板，用第46-54引物对分别进行PCR扩增反应，得到带有同源臂的第46-54线性化载体目的片段；