[发明专利]一种杆状病毒基因组的合成方法及其在重组杆状病毒构建中的应用

权利要求书

1.一种杆状病毒基因组的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括使用引物组合和穿梭载体，所述引物组合包括杆状病毒全基因组扩增引物组合和线性载体扩增引物组合，所述杆状病毒全基因组扩增引物组合包括第1-45引物对，其碱基序列分别如SEQ ID No.1-90所示；所述线性载体扩增引物组合包括第46-54引物对，其碱基序列分别如SEQ IDNo.91-108所示；所述穿梭载体的碱基序列如SEQ ID No.109所示。

2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述穿梭载体具有能在酵母和细菌中复制的能力，同时带有由Hsp70启动子启动的egfp基因，可在转染昆虫细胞时产生荧光，达到筛选的目的。

3.如权利要求1或2所述的合成方法在合成杆状病毒基因组中的应用，其包括：

以杆状病毒基因组为模板，用第1-45引物对分别进行PCR扩增反应，得到第1-45目的基因组片段；

以线性化的第一载体为模板，用第46-54引物对分别进行PCR扩增反应，得到带有同源臂的第46-54线性化载体目的片段；所述第一载体为pGF；

将所述第1-45目的基因组片段分为9组，9组目的基因组片段依次与带有同源臂的所述第46-54线性化载体目的片段对应；每一组的所述目的基因组片段与所述线性化载体目的片段一起转化到宿主细胞，得到第1-9重组质粒；

将所述第1-9重组质粒用BamHI酶切，得到线性化的第1-9重组片段；以所述线性化的第一载体为模板，以SEQ ID No.92和SEQ ID No.95为引物对、SEQ ID No.98和SEQ ID No.101为引物对、SEQ ID No.104和SEQ ID No.107为引物对，分别进行PCR扩增反应，得到带有同源臂的第55-57线性化载体目的片段；

并将所述第1-9重组片段，分为三组，第一组的3个线性化的所述重组片段与带有同源臂的所述第55线性化载体片段一起转化到所述宿主细胞，第二组的3个线性化的所述重组片段与带有同源臂的所述第56线性化载体片段一起转化到所述宿主细胞，第三组的3个线性化的所述重组片段与带有同源臂的所述第57线性化载体片段一起转化到所述宿主细胞，得到第10-12重组质粒；

用Bsu361限制性内切酶将所述第10-12重组质粒酶切，得到线性化的第10-12重组片段；以线性化的第二载体为模板，以所述SEQ ID No.101和所述SEQ ID No.104为引物对，进行PCR扩增，得到带有同源臂的线性化的第二载体目的片段；将所述第10-12重组片段与所述第二载体目的片段一起转化所述宿主细胞，得到杆状病毒基因组质粒；所述第二载体为pGF-egfp。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为VL6-48株酵母细胞的原生质体。

5.如权利要求1或2所述合成方法所得到的杆状病毒基因组在构建重组杆状病毒中的应用。