[发明专利]蛋白质纯化中提高病毒去除的方法

说明书

本申请是申请人于2010年8月6日提交的题为“蛋白质纯化中提高病毒去除的方法”的中国专利申请201080044790.3的分案申请。

发明背景

发明领域

本发明属于蛋白质纯化的领域。特别是本发明涉及通过在预过滤工艺中组合使用内毒素去除和阳离子交换基质，增加病毒滤器的过滤容量的方法。

相关技术的描述

由于能够进行正确的蛋白质折叠和翻译后修饰(例如糖基化(Chu和Robinson Current Opinion in Biotechnology 12:180–187,2001))的能力，哺乳动物细胞系已成为重组蛋白质生产技术的主要选择。然而，也已知这些细胞系含有逆转录病毒样颗粒(Lieber等人，Science 182:56–59,1973；Lubiniecki等人，Dev Biol Stand 70:187–191,1989)，并存在潜在的外来病毒污染的风险(Garnick,Dev Biol Stand.Basel:Karger 93:21–29,1998)。虽然生物制药产业生产的重组蛋白质药物具有良好的安全性记录，但是也有由血液和源自血浆的血液产品造成的病毒感染发生(Brown,Dev.Biol.Stand.81,1993；Thomas,Lancet 343:1583-1584,1994)。为了减少在重组蛋白质生产过程中病毒污染的风险，设计下游的纯化工艺包括去除内源性和外来病毒的加工步骤。通过若干提供从原料流(process feed stream)中失活病毒或去除病毒的加工步骤的组合，获得充分的病毒清除。使用例如在低pH下孵育、热和去垢剂处理的技术实现病毒失活，同时通常使用层析和过滤实施病毒去除(Curtis等人，Biotechnology and Bioengineering 84(2):179–186,2003)。

与基于物理化学性质(例如净电荷)去除病毒的层析基质不同，病毒过滤通过尺寸排阻去除病毒，因此被认为是更强效的技术。迄今为止，在源自哺乳动物细胞培养物的生物治疗剂的下游纯化过程中使用病毒过滤限于去除逆转录病毒(80-100nm直径)，这是因为缺少标称孔径小于60nm的高通量膜的结果。

近期在膜技术中的进步使得能够生产标称孔径20nm的高通量膜。这些病毒滤器滞留细小病毒(18-26nm直径)，允许通过大至160kD的蛋白质(～8nm)，例如单克隆抗体(mAb)。

高选择性和高通量的细小病毒滤器是通过在微孔底物上覆盖一层薄的滞留膜层获得的。该薄的滞留层允许非常精细的分离蛋白质和病毒，但也易于被加工原料流中的杂质结垢，导致较低的过滤容量和流动。病毒滤器结垢归因于污染物，例如蛋白质聚集体和变性的蛋白质。Bohonak和Zydney(Bohonak and Zydney,Journal of Membrane Science 254(1-2):71-79,2005)展示了滤器容量的丧失可能是由于滤饼形成或孔阻塞。其他近期的报道(Bolton等人，Biotechnol.Appl.Biochem.43:55-63,2006；Levy等人，Filtration in the Biopharamaceutical Industry.(Meltzer,T.H.和Jornitz,M.W.编著)第619-646页，Marcel Dekker,New York,1998)将滤器结垢的可能原因归因于孔壁对杂质的吸附。一些出版物(Bolton等人，Biotechnology and Applied Biochemistry 42:133-142,2005；Hirasaki等人，Polymer Journal 26(11):1244-1256,1994；Omar和Kempf,Transfusion 42(8):1005-1010,2002)也证实过滤容量的降低或孔的堵塞可以使病毒滞留减少若干数量级，影响单位操作的耐用性(robustness)。