[发明专利]一种突变型Tn5转座酶及其制备方法和应用

说明书

一种突变型Tn5转座酶及其制备方法和应用，对现有EK/LP Tn5转座酶进行降低DNA偏好性的定点突变，所述定点突变是指D97E，D188E、E326D中的至少两个，所述定点突变改进了Tn5转座酶蛋白序列和构象，并配合对反应体系的微调，改进Tn5转座酶对DNA靶序列插入的偏好性，显著改善了DNA建库均一性，并使建库结果具有更好的覆盖度，显著提高建库均一性，适应高通量测序建库的需求。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种突变型Tn5转座酶及其制备方法和应用。

背景技术

转座酶是一大类细菌来源的蛋白，通过结合转座子序列末端并催化其移动到基因组上随机位置实现“剪切-粘贴”或“复制-粘贴”型的DNA插入的作用。转座酶的种类很多，最先被发现的是能使玉米随机改变颜色的Tn3转座子。天然的转座子在生物中活性很低，在进化过程中起到随机改变遗传物质并推动进化的重要作用。转座酶可以在基因组上引入随机突变的重要性质也被应用于最近迅速发展的二代测序技术中的建库过程，可以在基因组上随机加入已知序列接头用于测序分析。

Tn5转座酶是转座酶的一种，Tn5转座酶进行转座功能的实现需要三个部分共同作用：转座子序列、转座酶、靶DNA位置。野生型Tn5转座酶的活性也是很低的，以减少对宿主产生致命突变的风险。

Tn5转座酶活性很低的部分原因在于其蛋白的N端和C端在三维空间构象上相互接近，并发挥相互抑制的作用。对于N端或C端的突变可以得到高活性形式的突变形转座酶，如L372P，正常的372位亮氨酸处于一个α螺旋中，用丙氨酸取代后使α螺旋结构被破坏，从而产生了C端构象的改变，与N端在空间上发生分离，从而得到活性大大增加的突变蛋白。同时Tn5蛋白含有一个中心催化结构域DDE，即不同位置的D/D/E三个残基在三维构象上形成一个中心的酸性基团，构成能结合二价离子的环形位置，该结构域的已知功能为促进蛋白在DNA上的行进，对这三个酸性残基的分别交换突变可以得到催化性增加、行进性提升的突变蛋白。

目前主流技术为对转座酶表达序列进行定点突变，通过原核表达产生有活性的突变蛋白，对其功能进行体外验证。由此得到最知名的突变即为上文提到的，N端和C端空间距离得到高活性蛋白和改变催化基团DDE基团内残基得到的催化活性增加的突变蛋白。

虽然现在主流使用的突变型Tn5转座酶转座插入活性和对DNA的亲和性都得到了有效增强，但在目前酶的活性和稳定性提升的基础上还是存在靶DNA序列偏好性，偏好性是转座酶应用于建库的一个短板，在建库过程中加接头的偏好性会导致结果的不均一和缺失，导致结果的覆盖度有问题。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种突变型Tn5转座酶及其制备方法和应用，降低Tn5转座酶对DNA靶序列插入位点选择性，使测序DNA建库分布更均一，并具有更好的覆盖度，适应高通量测序建库的需求。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种突变型Tn5转座酶，所述突变型Tn5转座酶的氨基酸序列为EK/LPTn5转座酶的氨基酸序列定点突变所得，所述定点突变是指D97E，D188E、E326D中的至少两个；其中，突变位点1：D97E，即EK/LP Tn5转座酶基酸序列中第97位的丙氨酸突变为谷氨酸；突变位点2：D188E，即EK/LP Tn5转座酶基酸序列中第188位的丙氨酸突变为谷氨酸；突变位点3：E326D，即EK/LP Tn5转座酶基酸序列中第326位的谷氨酸突变为丙氨酸。

优选的，一种突变型Tn5转座酶，包含3个定点突变：D97E，D188E、E326D，该突变型Tn5转座酶的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。

本发明还提供编码氨基酸序列如SEQ NO.2所示的突变型Tn5转座酶的基因。