[发明专利]一种突变型Tn5转座酶及其制备方法和应用有效
| 申请号： | 201611196754.4 | 申请日： | 2016-12-21 |
| 公开（公告）号： | CN106754811B | 公开（公告）日： | 2019-05-14 |
| 发明（设计）人： | 曹林;张力军;聂俊伟;齐心;韩锦雄;瞿志鹏;徐晓昱 | 申请（专利权）人： | 南京诺唯赞生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/12 | 分类号： | C12N9/12;C12N15/54;C12N15/10;C12N15/70;C40B50/06;C12Q1/6806 |
| 代理公司： | 南京天华专利代理有限责任公司 32218 | 代理人： | 杜静;徐冬涛 |
| 地址： | 210038 江苏省南*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 建库 定点突变 制备方法和应用 均一性 偏好性 突变型 高通量测序 蛋白序列 覆盖度 构象 微调 改进 配合 | ||
1.一种突变型Tn5转座酶，其特征在于，所述突变型Tn5转座酶的氨基酸序列为EK/LPTn5转座酶的氨基酸序列定点突变所得，所述定点突变是指D97E、D188E、E326D中的至少两个；
其中，突变位点1：D97E，即EK/LP Tn5转座酶基酸序列中第97位的天冬氨酸突变为谷氨酸；
突变位点2：D188E，即EK/LP Tn5转座酶基酸序列中第188位的天冬氨酸突变为谷氨酸；
突变位点3：E326D，即EK/LP Tn5转座酶基酸序列中第326位的谷氨酸突变为天冬氨酸；
编码所述突变型Tn5转座酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的突变型Tn5转座酶，其特征在于，所述突变型Tn5转座酶包含3个定点突变：D97E、D188E、E326D，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1或2所述的突变型Tn5转座酶在DNA建库中的应用。
4.一种利用权利要求1或2所述突变型Tn5转座酶进行基因组DNA片段化的方法，其特征在于，所述方法的反应体系为：10~25mM HEPES缓冲液，pH 7.2~7.6；0.1~5mM beta-巯基乙醇；10~80μg/ml牛血清白蛋白；0.1~0.2M谷氨酸钾；0.2~0.5mM MnSO4；0.2~1mM KCl；100~500nM 所述突变型Tn5转座酶；50~100ng 基因组 DNA；0.1~1ng含有19bp 转座子序列的接头引物；反应程序：37℃，10min~1h；
其中，所述接头引物包括：转座酶识别序列：AGATGTGTATAAGAGACAG；第一接头序列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC；第二接头序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCTCGTGGGCTCGG。
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