[发明专利]以肉质为目标导向的肉牛育肥方法

权利要求书

1.一种以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1）眼肌面积检测及分类，通过超声波技术对待测犊牛进行眼肌面积检测，计算眼肌面积数值，具体是：

（1.1）对犊牛进行保定，以确保其自然站立；

（1.2）测量时探头放上耦合剂，剪掉测量部位毛，探头直接放在体表；腰肌面积在横断面第十二、十三肋间测量，腰肌面积是一个圆周测量；在识别超声影像时首先确定皮肤界面、脂间结缔组织和背最长肌肌膜所产生的 3~4 条强回声影带，然后确定眼肌四周肌膜的强回声影像，以确定眼肌面积周界；观察并调节屏幕影像，调节灰度、对比度、增益度，使近场增大，远场减小，获得理想影像时即冻结影像，并加注说明资料影像打印或存贮处理；图像读取时先确定上下界即椭圆短轴，然后确定两端界点即为椭圆长轴；此时屏幕上显示的平方厘米值就是近似椭圆形的眼肌的面积；

（1.3）眼肌面积的大小范围，分为“偏大、中等偏上、其它”3个档次，对群体待测数据进行测定，计算平均值P1，选出最大值Max，进而计算最大值与平均值的平均数P2；大于等于P2的个体，归类为“偏大”；大于等于P1，小于P2的个体归类为“中等偏上”；小于P1的个体归类为“其它”；

步骤（2）待选基因的检测与分型，通过PCR-SSCP技术进行2组基因，CAPN1+CAST、GH+GHR的检测及分型，具体是：

（2.1）引物设计：设计以下引物序列

CAPN1基因Intron14上游引物序列：5’-GACAGGAATACAGTAGGGAC-3’

CAPN1基因Intron14下游引物序列：5’-GAGAACAGCTACCCAGGGAC-3’

CAST基因Intron3上游引物序列：5’-CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-3’

CAST基因Intron3下游引物序列：5’-TACACCCTGCTTTGTCCTCCA-3’

GH基因3‘UTR上游引物序列：5’-CACTCCCACTGTCCTTTCCTA-3’

GH基因3‘UTR下游引物序列：5’-ACTTCCTCACATGTTGGAGGC-3’

GHR基因Exon10上游引物序列：5’-TAACTTCATCGTGGACAA-3’

GHR基因Exon10下游引物序列：5’-GGAGGTATAATCTGGGAC-3’

（2.2）根据已设计的引物，按照以下PCR 反应体系和条件进行扩增

PCR反应体系：10×Ex Taq Buffer 2.5μl；dNTP Mixture2.0μl；模板 DNA1.0μl；上游引物F、下游引物R各1.0μl，浓度均为10pmol/μl；浓度为5U/μl的Ex Taq 0.25μl，ddH₂O17.25μl，总体积 25.0μl；其中，10×Ex Taq Buffer 表示10倍ExTaq酶缓冲液；dNTPMixture表示dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液，每种的浓度均为2.5mM，mM表示毫摩尔每升；Ex Taq表示Ex Taq DNA聚合酶；ddH₂O表示双蒸水；

反应条件：95℃预变性 5min 后进入如下循环：94℃变性 30s，60－65℃退火30-45s，72℃延伸 30-45min，30-35 个循环，然后 72℃延伸 10min，4℃保存；

（2.3）PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳：所有凝胶电泳均用浓度为 1％琼脂糖/EB 凝胶，在1×TAE 缓冲液下进行；10μlPCR扩增产物与 1/6 体积6×Loading Buffer混匀，加样至点样孔中，以 7～10V/cm的电压电泳，当溴酚蓝电泳至2~4cm，在紫外灯下观察结果并用凝胶成像仪观察，照相，PCR产物条带清晰，大小符合预期设计结果，进行下一步分析；其中1×TAE 缓冲液的配置：先配置50×TAE缓冲液:Tris 242g，冰乙酸57.1m1，pH 值为8.0、浓度为0.5M 的EDTA 100m1，加水至1000ml，然后稀释50倍以后即可得到1×TAE 缓冲液；

（2.4）扩增产物的 PCR-SSCP 分析：体积为40ml的非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳根据不同的扩增片段，采用浓度为30%的丙烯酰胺配成浓度为8%～12%的聚丙烯酰胺凝胶；清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用大号铁夹固定，并用 0.8%琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙；在 100 ml 烧杯内加入浓度为30%丙烯酰胺 12.0 ml，5.0 ml的浓度为50%甘油，5×TBE缓冲液10.0 ml，浓度为10%过硫酸铵 350μl，TEMED 8 μl，加入双蒸水 13.0ml，混合后迅速灌胶；当胶灌至离玻璃板上沿 1.0 cm 时停止灌胶，插入梳子，室温聚合 30 min，多余的丙烯酰胺 4℃保存；随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺；凝胶聚合好后，拔掉梳子，向电泳槽加入 1×TBE，用注射器冲洗加样孔；预电泳 10 min，同时准备点样；取 1 μl PCR 产物置于 PCR 管中，加 5 μl 变性Buffer，离心混匀，98℃变性 10min；迅速冰浴 10 min，用微量注射器点样；4℃，140～180V，电泳 14～16 h；电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于400~600ml浓度为70%的乙醇中，水浴震荡器缓慢摇匀固定 10~15 min；去离子水洗胶 2 遍，每次 2 min，洗去乙醇；用 200 ml 染色液染色 30 min；去离子水洗胶 3 遍，每次 2 min，洗去多余的染色液；用 200 ml 显色液显色，10～30 min，当 DNA条带清晰时，倒掉显色液；去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存，然后进行基因分型；其中，浓度为30%的丙烯酰胺的配置是29克丙烯酰胺和1克双丙烯酰胺，用蒸馏水定容100ml，过滤后使用；5×TBE缓冲液：Tris碱54g，硼酸27.5g，pH值为8.0、浓度为0.5M 的EDTA 20ml，加水至1000ml所得；0.5M EDTA配置方法为：EDTA186.1g溶于800m1双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌后使用；1×TBE即5×TBE缓冲液稀释5倍后所得溶液；

步骤（3）根据眼肌面积与基因分型结果，确定育肥模式，具体是：

（3.1）眼肌面积中等偏上，或检测到CAPN1_BB基因型+CAST_AA基因型的个体，用于生产高档雪花肉，育肥阉牛至26-30月龄，采取“生长发育期+营养平衡期+肉质改良期”三段式育肥模式；

（3.2）眼肌面积偏大，或检测到GH_BB基因型+GHR_AA基因型的个体，生产西餐红肉，育肥公牛至16-20月龄，采取“生长发育期+肉质改良期”两段式育肥模式；

（3.3）其它牛生产大理石肉；

步骤（4）公、阉牛区分：选择对象为公牛，正常育肥；选择对象为阉牛，阉割后育肥；

步骤（5）出栏时间：分为26-30月龄、16-20月龄、20-22月龄、22-24月龄4种；

步骤（6）分段式营养调控：三段式育肥或两段式育肥；三段式育肥中生长发育期日粮精粗比为40:60；日粮干物质含量为63.1％，采食量为15.2kg/d·头，干物质采食量为9.6kg/d·头。