[发明专利]雷公藤焦磷酸合酶TwCPS4及其制备松香烷型二萜化合物的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及通过基因工程方法获得二萜类化合物合成的关键酶，特别涉及雷公藤二萜合酶及其在松香烷型二萜化合物制备中的用途。

背景技术

药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii.Hook.f.)是一味中草药，

被广泛用于类风湿性关节炎和炎症的治疗(Raphaela G M，Mildred W，Roy F，et al.Comparison of Tripterygium wilfordii Hook F Versus Sulfasalazine in the Treatment of Rheumatoid Arthritis：A Randomized Trial[J].Annals of Internal Medicine，2009，151(4)：229-240.Tao X L，Lipsky P E.The Chinese anti-inflammatory and immunosuppressive herbal remedy Tripterygium wilfordii Hook F.[J].Rheumatic Disease Clinics of North America，2000，26(1)：29-50.)。萜类成分为雷公藤的主要活性成分，包括雷公藤甲素(triptolide)、雷酚内酯(triptophenolide)和雷公藤红素(celastrol)等。从中药中的活性成分开发新药是一种很有潜力的方式，然而由于植物的生长缓慢，再加上这些有效成分在植物体中的含量不多，因而大大限制了它的发展。通过探寻和阐释萜类成分在雷公藤中的生物合成途径及其调控机制，有助于为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。

二萜类化合物通常以GGPP为底物，在二萜合酶复合体的催化作用下形成，即IPP通过一系列的反应形成GGPP后，二萜合酶复合体以GGPP为起始底物，经过最初的离子异构化后环化形成各种阳离子中间产物，最终通过去质子或捕获亲核物质进一步环化形成一系列的二萜骨架中间体；并通过细胞色素P450结构修饰，主要包括羟基化、甲基化、异构化、脱甲基化、加成和还原等，最终生成二萜类化合物。

雷公藤中二萜类化合物结构复杂、种类繁多，合成代谢途径尚不完全清楚。目前基于基因组序列分析和表达序列标签分析，对雷公藤二萜合酶复合体中的部分酶活性蛋白进行了初步预测，但远远不能满足雷公藤二萜化合物生物合成的需求，不能解释雷公藤二萜化合物种类的多样性，更不能确定预测的酶活性蛋白具体导致了何种二萜类产物，因此迫切需要挖掘雷公藤二萜合酶复合体中新的酶活蛋白，并确定其具体的催化功能。

雷公藤甲素具有抗肿瘤、抗炎、抗排异、抗生育等药理作用，雷公藤甲素与丹参酮类化合物同属松香烷型二萜。酶催化制备丹参酮的方法已有报道，但酶催化制备雷公藤甲素尚未获得成功。针对雷公藤甲素、丹参酮共同的松香烷型二萜化合物前体进行研究能够为最终酶催化法合成雷公藤甲素打下基础。

发明内容

发明人团队在对雷公藤二萜合酶复合体中的酶活蛋白进行研究过程中，意外的发现了一种与TwCPS1序列相似的柯巴基焦磷酸合酶。最初认为其是TwCPS1的天然突变等效物，随后进一步的研究表明其与TwCPS1同时稳定存在于同一株雷公藤悬浮细胞中，并且二者在经茉莉酸甲酯诱导时的过表达情况也不同。新发现的柯巴基焦磷酸合酶对诱导的反应更快，负责诱导初期松香烷型二萜化合物的合成和累积，而TwCPS1对诱导的反应滞后，负责诱导中后期松香烷型二萜化合物的合成和累积，因此将这种新的柯巴基焦磷酸合酶命名为TwCPS4。

将克隆得到的雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps4和丹参中的Smksl1基因分别构建表达载体，成功生成了次丹参酮二烯。进一步证实了TwCPS4在合成雷公藤甲素等松香烷型二萜合成中的作用，且提供了一种合成松香烷型二萜前体的方法，为雷公藤甲素的生物合成奠定基础。