[发明专利]一种皮肤干细胞经异位发育分化为精子的技术方法

说明书

本发明涉及一种诱导皮肤干细胞分化为精子的方法，首先将小鼠皮肤干细胞与经过丝裂霉素C处理的成纤维细胞共培养，诱导其向PGC分化，然后将PGC细胞混合液通过受体鼠输出小管逆向注射到睾丸曲细精管内；在受体鼠睾丸内发育一个月，取出受体鼠睾丸，HE染色分析发现曲细精管内恢复精子发生，并且有典型精子形态的细胞出现，且恢复精子发生的曲细精管中生精细胞表达GFP和MVH等。本发明所述方法对机体伤害小、无伦理问题限制，能够有效诱导皮肤干细胞分化为精子细胞，分化效率高，分化所得精子细胞具有典型精子形态，同时表达精子细胞特异基因。

技术领域

本发明涉及一种皮肤干细胞经过体内发育分化为精子的方法，属于生物医学的干细胞与组织工程学技术领域。

背景技术

近年来，男性不育患者约占我国育龄人口的10%，而40%以上的男性不育是由于精子发生异常造成的。虽然辅助生殖技术给许多患者带来了曙光，但是单靠辅助生殖和药物治疗还远远不够。利用干细胞向生殖细胞的定向分化可以在体外建立生殖细胞发生的模型并最终获得功能性配子，这对研究生殖细胞发生的调控机制以及治疗男性不育症等方面具有重要意义。

干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。成体干细胞是指存在于已分化组织中的未分化细胞，这些细胞多数处于休眠状态且维持其多能性，一定条件下，它们能够自我更新并且能够分化形成特异组织的细胞类型，表现出其多向分化潜能。相对于其它成体干细胞，皮肤干细胞广泛分布于人体最大的器官且取材更为方便，在临床应用上没有免疫排斥和伦理性问题，因此，皮肤来源的干细胞向生殖细胞分化备受关注。

然而，皮肤干细胞体外向精子诱导分化的报导很少，至今仍没有相关报道。其他成体干细胞体外向精子分化的研究也大多数来至精原干细胞。1994年，Hofmann等在体外建立了精原干细胞系，而且这些细胞系在特定的条件下能够进入减数分裂，但最终无法获得单倍体细胞，表明这个细胞系在体外培养的条件下不能突破减数分裂期。2002年，Feng等在体外建立一种细胞系，而这些细胞在干细胞因子的诱导下能够突破减数分裂并产生顶体样结构。但是由于后续没有被其他实验室重复，所以至今仍未被广泛利用。

发明内容

为解决现有技术中存在的上述缺陷并发扬优点，本发明旨在提供一种首次采用皮肤干细胞作为原始细胞，对机体伤害小、无伦理问题限制的小鼠皮肤干细胞经过体内发育分化为精子的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种皮肤干细胞经过体内发育分化为精子的方法，包括将皮肤干细胞诱导分化为原始生殖细胞、将原始生殖细胞植入受体鼠睾丸获得精子细胞两个步骤，其中：

1）将皮肤干细胞诱导分化为原始生殖细胞具体为：

①皮肤干细胞准备：分别提取培养了1-2代绿色荧光转移基因小鼠的皮肤干细胞与野生型小鼠成纤维细胞，并将野生型小鼠成纤维细胞采用丝裂霉素C处理，然后将皮肤干细胞与处理后的成纤维细胞按照质量比1:1的比例混合后待用；

②选用DMEM高糖培养基作为原始生殖细胞诱导培养基，并在该培养基内加入以DMEM高糖总质量计8%~12%质量分数的胎牛血清、以DMEM高糖总体积计40 mIU/ml~60 mIU/ml促卵泡素、80 IU/ml~120 IU/ml白血病抑制因子、15ng/ml~25 ng/ml骨形态发生因子、0.20 mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸钠、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巯基乙醇, 8ng/ml~12 ng/ml表皮生长因子, 15ng/ml~25 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 30ng/ml~50ng/ml干细胞生长因子；培养温度35℃-38℃，湿度不低于80%，环境中CO₂浓度4%-6%；