[发明专利]一种单细胞全基因组的测序方法

说明书

本发明提供了一种单细胞全基因组的测序方法，包括以下步骤：对单细胞进行分离并裂解；对单细胞的全基因组DNA进行单细胞全基因组扩增；对扩增产物进行质量检测；对检测合格的扩增产物进行捕获并构建DNA测序文库；高通量测序；其中，对扩增产物进行质量检测包括步骤：检测该扩增产物中的DNA片段长度，将最大DNA片段的长度与预设值进行比较，判断扩增产物的质量是否合格，最大DNA片段的长度大于预设值的扩增产物，其质量检测合格。本发明对于扩增后扩增产物质量的检测方法步骤简单，不需要另外合成引物，成本低，而且检测扩增产物需要的起始量少，检测结果准确有效，具有很强的实用性。

技术领域

本发明涉及单细胞测序领域，具体地说是一种单细胞全基因组的测序方法。

背景技术

单细胞全基因组测序是指在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术，其方法是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA先进行扩增，获得高覆盖率的完整基因组后再进行高通量测序，用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。2014年1月《自然·方法学》(Nature Methods)上发表年度特别报道，将“单细胞测序”(Singled out forsequencing)的应用列为2013年度最重要的方法学进展，可见单细胞测序技术的重要性。哈佛大学终身教授、美国科学院院士谢晓亮教授于2012年发表了关于多重退火和成环循环扩增技术(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles，MALBAC)的论文，该技术能够降低单细胞全基因组的PCR扩增偏倚，使得单细胞中93％的基因组能够被测序，使得检测单细胞中较小的DNA序列变异变得更容易，因此能够发现个别细胞之间的遗传差异。这样的差异可以帮助解释癌症恶化的机制，生殖细胞形成机制，甚至是个别神经元的差异机制，有着广阔的应用前景。

由于单细胞基因组的DNA含量为皮克级水平，而目前的测序技术要求起始DNA量为微克级水平，因此，必须先将单细胞基因组进行全基因组扩增(WGA)使之达到足够量才能进行测序，也就对核酸扩增技术(amplification technology)提出了更高的要求。单细胞质量会很大程度的影响单细胞的预扩增以及全基因组的覆盖率，而面对如此微量的DNA，任何降解、样品损失、或者污染都会对测序结果带来非常严重的影响，也就无法保证扩增达到100％的成功率。鉴于单细胞基因组DNA质量的难以估量(～6pg)以及测序的昂贵成本，在测序甚至建库之前，对单细胞全基因组扩增的覆盖率进行准确的预估，是非常重要意义的。

公告日为2014年4月30日，公告号为CN102533960B的中国专利中公开了“一种单细胞基因组分析方法及试剂盒”。该专利采用Housekeeping Gene检测方法，对单细胞全基因组的扩增产物进行质量检测。该方法需要对位于10个不同染色体上的10个基因分别进行PCR扩增，每个反应需分别进行单独扩增和电泳检测；每个反应都需要15ng的模板量，则完成单个样品的质量检测需耗费150ng基因组扩增产物。此方法不仅繁琐，并且浪费试剂和单细胞基因组扩增样品。

公布日为2015年7月8日，公布号为CN104762405A的中国专利申请中公开了“一种单细胞基因组扩增后扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒”。该专利采用5对基因组上保守区段的特异性引物，将其放在一个扩增体系中，以全基因组扩增产物为模板进行PCR扩增，对5个扩增产物进行电泳检测，根据检测结果判断全基因组扩增产物的质量。该方法需要对位于5个不同染色体上的5个基因进行PCR扩增，PCR操作于同一反应体系，虽然可以减少模板的浪费，但同一体系中多个反应极易造成非特异性扩增。且电泳的分辨率不高，容易导致误判，影响后续测序结果的准确性。

发明内容

本发明的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种单细胞全基因组的测序方法，该测序方法在建库测序之前能对扩增产物进行质量检测，不仅成本低，而且质控检测所需的起始量低，同时操作简单。

一种单细胞全基因组的测序方法，包括以下步骤：