[发明专利]一组岩藻糖基转移酶突变体及其筛选方法和应用

说明书

本发明涉及一组岩藻糖基转移酶突变体及其筛选方法和应用。本发明通过针对岩藻糖基转移酶的荧光底物设计，结合流式细胞荧光分选的高通量筛选方法，获得了一组催化活力明显提高的岩藻糖基转移酶突变体。本发明还涉及了岩藻糖基转移酶突变体在岩藻糖基化寡糖及其糖缀合物合成中的应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一组催化活性提高的α1,3-岩藻糖基转移酶突变体。

背景技术

岩藻糖基化是生物体内一类常见的糖基化修饰，在许多复杂的生理过程中发挥着不可替代的重要作用。许多含岩藻糖基的异常糖链结构与肿瘤的发生和发展密切相关，因此含岩藻糖基的寡糖和糖缀合物(包括糖蛋白、糖脂等)可以作为肿瘤诊断的关键分子标记，也被研究开发成抗肿瘤糖疫苗用于癌症免疫治疗。而且，在人乳中富含岩藻糖基化的寡糖，是重要的益生元，具有增强婴儿免疫力、促进大脑发育等功能,可应用于婴儿配方奶粉、食品添加剂等领域。因此，岩藻糖类寡糖和糖缀合物的合成日益受到科学家和医药公司的重视。

但目前化学法只能合成极少数寡糖，而且需要复杂的保护/脱保护步骤来控制产物的区域选择性和立体选择性，导致合成路线长、产率低、成本极高。岩藻糖基转移酶(Fucosyltranferase，FucT)催化糖苷键合成具有高度的区域选择性和立体选择性，与化学法相比具有条件温和、产率高、分离纯化容易等一系列优点，在合成岩藻糖相关的化合物中具有重要价值。应用现代生物技术，开发具有优良性质的岩藻糖基转移酶对于发展酶法合成寡糖具有重要意义，是受到世界各国学者高度关注的研究热点。

岩藻糖基转移酶广泛地分布于脊椎动物、无脊椎动物、植物和细菌中。由于来源于细菌的岩藻糖基转移酶比真核生物来源的更容易过量表达，且受体底物选择性更为宽泛，被广泛用于寡糖和糖缀合物的合成。但与其他糖基转移酶相比，这类酶的催化活性较低，因此限制了其大规模的广泛应用，如天然能够产生岩藻糖基转移酶的原始菌种(如Helicobacter pylori NCTC11639)催化活性较低，不能满足工业生产岩藻糖基化寡糖的要求。由于糖基转移酶催化反应不直接产生荧光或光吸收信号，对其进行高通量筛选一直是个难题。现行的方法均基于96孔板进行筛选，需用到大量昂贵底物，筛选成本极高，而且存在耗时、费力、筛选通量低(不超过10⁵)等弱点。

综上，亟需找到一种岩藻糖基转移酶高通量筛选的方法，并获取高催化活性的岩藻糖基转移酶，以应用于含岩藻糖基的寡糖和糖缀合物的合成中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种岩藻糖基转移酶突变体及其筛选方法和应用。

在本发明的第一方面，提供一种岩藻糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变与SEQ ID NO:2具有至少90％的氨基酸序列一致性，且包含以下至少一个或多个位置的突变，所述的突变位点包括SEQ ID NO:2的第45、127、128、131、146、199、223、340、368、383或407位中的至少一个或者其相应的位置；

优选地，所述糖基转移酶的突变与SEQ ID NO:2具有至少93％的氨基酸序列一致性；更优选地，与SEQ ID NO:2具有至少95％的氨基酸序列一致性；

所述的突变为在所述的突变位点上发生取代、插入或删除一个或多个氨基酸残基；

优选地，所述岩藻糖基转移酶的催化活性可提高至少40％。

优选地，所述的突变为取代突变，至少包含以下一个或多个氨基酸残基的取代：

第45位的丝氨酸被苯丙氨酸取代；或

第127位天冬氨酸被天冬酰胺取代；或

第128位的精氨酸被谷氨酸或酪氨酸取代；或

第131位的组氨酸被异亮氨酸或亮氨酸或甲硫氨酸取代；或

第146位的赖氨酸被天冬酰胺取代；或