[发明专利]一种莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的筛选方法。

背景技术

随着重工业化的不断发展，国内重金属污染问题也日益加重。大量的重金属进入大气、水、土壤之后，将会打破自然的生态平衡。同时通过水循环、大气循环、以及食物链等，重金属最终会在我们人体中富集，威胁到人类的身体健康。重金属污染与其他环境污染物不同，重金属污染很难在环境中自然降解，因此，如何将重金属从环境中富集回收，是解决重金属污染问题的关键所在。

在众多重金属污染中，镉污染情况最为严重。工业废气是镉污染的主要来源，通过降雨，大气中的镉便会积累在土壤中。由于电镀，采矿等工业废水的排放，灌溉水也被污染，进而累积到了土壤中。再者农田中施用的一些含镉的化肥，这些也会污染土壤。现有技术中通常采用物理化学方法对污水中的镉进行处理，常用方法有沉淀法、吸附法、高分子捕集剂法、离子交换法等等，但是极易造成二次污染。

莱茵衣藻是一种单细胞真核生物，具有吸附重金属的能力。衣藻吸附重金属过程主要分为生物吸附和生物累积，前者是细胞壁物理吸附过程，后者则是细胞生理代谢的累积过程。相对于传统的废水处理方法而言，衣藻具有环保、经济和高效等优点。

发明内容

本发明提供一种莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的筛选方法，基于上述技术问题，达到了提供能够简单、高效地获得大量的衣藻重金属镉吸附突变体技术效果。

为解决上述技术问题，本发明提供一种莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的筛选方法，所述筛选方法包括：

根据不同氯化镉浓度对莱茵衣藻生长的影响，选择合适的重金属镉吸附突变体筛选浓度；

电击转化获得莱茵衣藻突变体；

筛选出莱茵衣藻重金属镉吸附突变体；所述筛选出莱茵衣藻重金属镉吸附突变体，包括：筛选重金属镉敏感型突变体和筛选重金属镉抗性突变体；

鉴定筛选出的莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的突变基因。

优选的，所述根据不同氯化镉浓度对莱茵衣藻生长的影响，选择合适的重金属镉吸附突变体筛选浓度，包括：

培养莱茵衣藻；

配置固体TAgP氯化镉浓度呈梯度的培养基；

将培养好的莱茵衣藻分别置于所述固体TAgP氯化镉浓度呈梯度的培养基中，根据莱茵衣藻在不同浓度呈梯度的培养基中的生长状况，选择重金属镉敏感型突变体筛选浓度和重金属镉抗性突变体筛选浓度。

优选的，所述配置固体TAgP氯化镉浓度呈梯度的培养基，具体为：

向TAgP中加入不同浓度梯度的氯化镉，具体浓度为0mM,、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM。

优选的，所述根据莱茵衣藻在不同浓度呈梯度的培养基中的生长状况，选择重金属镉敏感型突变体筛选浓度和重金属镉抗性突变体筛选浓度，具体为：

将培养好的野生型莱茵衣藻21gr分别滴在不同氯化镉浓度梯度TAgP固体培养基上，培养五天后，观察记录，根据具体结果，选取0.4mM氯化镉作为用于筛选重金属镉敏感型突变体的筛选浓度和0.6mM氯化镉作为用于筛选重金属镉抗性突变体的筛选浓度。

优选的，所述电击转化获得莱茵衣藻突变体，包括：

制备aphⅧ目的片段；

配备经过过滤除菌的0.4％PEG6000和以TAP为基础的培养基和预设细胞浓度的莱茵衣藻；

制备莱茵衣藻感受态细胞；

电击获得莱茵衣藻突变体；

细胞涂板；

挑取细胞转化子。

优选的，所述制备aphⅧ目的片段，具体包括：

通过构建的质粒pJMG-aphⅧ，所述质粒pJMG-aphⅧ含有Paro抗生素筛选的DNA片段(aphⅧ)；采用EcoR Ⅰ酶切，胶回收aphⅧ片段；

预设细胞浓度的莱茵衣藻包括：将莱茵衣藻21gr在TAP吹气瓶中培养至对数期后，转接到200mL的三角瓶中，置于摇床培养8-16小时，以200rpm的转速并连续光照；直至细胞浓度为4x10⁶cells/ml。

优选的，所述电击获得莱茵衣藻突变体，包括：

在电击杯中加入250ul衣藻感受态细胞和aphⅧ目的片段100-200ng；在电击仪BTX ECM630进行电击，电击最佳时间为10ms到14ms；电击完毕后，立即将电击杯放置冰上，静置5-10min；其中，在制备衣藻感受态细胞和电击转化过程中，需要保持细胞处于无菌状态。